体外HMGB1二聚化检测
验证HMGB1在体外是否形成二聚体及其依赖性
将重组HMGB1与LPS或LTA及H2O2在正常小鼠血清中孵育，通过非还原SDS-PAGE检测二聚体形成。
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ROS锚定的PAMPs介导的胞外HMGB1自身结合及其二聚化增强促炎信号
ROS anchor PAMPs-mediated extracellular HMGB1 self-association and its dimerization enhances pro-inflammatory signaling.
实验完整度
高研究包含体外生化实验（二聚化、ELISA、SPR）以及细胞实验（NF-κB信号、TNF-α产生），并包含小鼠体内验证，具备多层级验证。
主要模型
HEK293T细胞 HEK293-hTLR4A/MD2/CD14细胞 RAW264.7小鼠巨噬细胞 J774A.1小鼠巨噬细胞
重点核对
HMGB1二聚化依赖Cys106残基，突变C106A阻断二聚化 二聚化由H2O2和PAMPs（LPS/LTA）诱导，NAC和DTT抑制 HMGB1以单体形式分泌，在胞外形成二聚体 Di-HMGB1与TLR4和TLR2的结合亲和力高于单体（KD值分别为8.6×10^-8 M和1.523×10^-8 M） NF-κB信号和TNF-α产生在Di-HMGB1处理下显著增强
摘要
许多细胞蛋白通过二聚化形成同源或异源寡聚复合物，配体寡聚化对于诱导受体寡聚化至关重要。分子间二硫键的形成对于调节生物学功能的蛋白寡聚化至关重要。HMGB1是一种核蛋白，分泌后作为损伤相关分子模式（DAMP）发挥作用。HMGB1对氧化还原敏感，含有三个半胱氨酸：Cys23、Cys45和Cys106，其功能取决于胞外空间的氧化还原状态。然而，胞外HMGB1的同源二聚化及其免疫学意义尚未被确定。在本研究中，我们研究了Cys106介导的HMGB1同源二聚化的免疫学意义。在胞外环境中，LPS和LTA诱导HMGB1自身结合，导致H2O2锚定Cys106-Cys106介导的HMGB1分子间二硫键形成。尽管用H2O2、LPS或LTA处理，Cys106残基突变、ROS清除剂NAC和硫醇还原剂DTT的存在仍阻止了HMGB1二聚化。炎症刺激诱导单体HMGB1的分泌，而非二聚体HMGB1。HMGB1二聚化在胞外环境中由PAMPs和H2O2促进。与单体HMGB1相比，Cys106-Cys106连接的二聚体HMGB1通过增加对TLR2和TLR4的直接结合亲和力以及HMGB1介导的PAMPs向其受体的有效递送，显著增强了细胞内NF-κB信号传导和细胞因子产生。因此，我们证明了二聚体HMGB1增强了其对促炎信号的作用。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 胞外HMGB1是否发生同源二聚化及其免疫学意义如何？
- 核心机制
- 在氧化条件下，HMGB1通过Cys106之间的分子间二硫键形成反向平行二聚体，PAMPs（如LPS和LTA）作为锚定平台促进此过程，二聚体增强与TLR2和TLR4的结合亲和力，从而增强NF-κB信号和TNF-α产生。
- 主要证据
- 体外二聚化实验显示HMGB1在H2O2和PAMPs存在下形成二聚体，而C106A突变体不形成；ELISA和SPR显示Di-HMGB1与TLR4和TLR2结合增强；细胞实验显示Di-HMGB1增强NF-κB磷酸化和TNF-α产生。
- 研究意义
- 研究揭示胞外HMGB1二聚化在炎症中的新机制，可能为免疫紊乱提供新的治疗靶点，并提示Di-HMGB1的检测可能对脓毒症诊断有意义。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
HMGB1分泌形式分析
确定HMGB1分泌时是单体还是二聚体
将HEK293T或HEK293-hTLR4A/MD2/CD14细胞转染HMGB1或(HMGB1)2，用LPS或氧化应激处理，收集上清，进行非还原SDS-PAGE和免疫印迹。
HMGB1二聚化方向验证
验证二聚体中HMGB1的取向
通过单分子pull-down和双分子荧光互补（BiFC）实验，检测GFPN和GFPC标记HMGB1的相互作用。
二聚体HMGB1与受体结合分析
比较单体与二聚体HMGB1与TLR4和TLR2的结合亲和力
使用ELISA和表面等离子共振（SPR）检测HMGB1、Di-HMGB1和(HMGB1)2与TLR4/MD2和TLR2的结合，并计算KD值。
NF-κB信号通路激活分析
评估二聚体HMGB1对NF-κB信号的影响
用HMGB1、Di-HMGB1或(HMGB1)2处理RAW264.7细胞，通过免疫印迹检测磷酸化p65水平，并观察核转位。
TNF-α产生分析
评估二聚体HMGB1对巨噬细胞TNF-α产生的影响
用HMGB1、Di-HMGB1或(HMGB1)2处理RAW264.7和J774A.1细胞，ELISA检测TNF-α水平。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证样本或模型特征
验证机制链路
评估体内效果
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Corning Cellgro | 35-015-CV |
| 胎牛血清 | Corning Cellgro | 35-015-CV | |
| Normocin™抗生素 | InvivoGen | -- | |
| 杀稻瘟菌素 | -- | -- | |
| 潮霉素B | -- | -- | |
| 转染 | FuGeneHD转染试剂 | Promega Corporation | E2311 |
| 蛋白纯化 | 镍柱 | -- | -- |
| 肝素柱 | -- | -- | |
| 凝胶过滤柱 | -- | -- | |
| Triton X-114 | -- | -- | |
| 鲎阿米巴样细胞裂解物检测 | Lonza Bioscience | 50-650U | |
| HMGB1二聚化实验 | 过氧化氢 | -- | -- |
| 脂多糖 | Sigma-Aldrich | L5293 | |
| 枯草芽孢杆菌脂磷壁酸 | Sigma | L3265 | |
| 二硫苏糖醇 | -- | -- | |
| N-乙酰半胱氨酸 | -- | -- | |
| 多粘菌素B | -- | -- | |
| 免疫沉淀 | TLR4/MD2重组蛋白 | R&D Systems | 3146-TM/CF |
| 小鼠抗TLR4抗体 | Cayman | 13589 | |
| Dynabead蛋白G磁珠 | Biorad | 1614023 | |
| 兔抗HMGB1抗体 | Abcam | ab18256 | |
| 兔抗MD2抗体 | Abcam | ab24182 | |
| 兔抗TLR4抗体 | Sigma-Aldrich | SAB5700648 | |
| 细胞裂解 | RIPA裂解液 | GenDePOT | R4100 |
| 蛋白酶抑制剂混合物 | GenDEPOT | HY-K0010 | |
| 磷酸酶抑制剂混合物 | Thermo Scientific™ | 78420 | |
| 免疫印迹 | 硝酸纤维素膜 | GE Healthcare | 10600001 |
| 小鼠抗Myc抗体 | Invitrogen | 13-2500 | |
| 兔抗磷酸化NF-κB p65 (Ser536)抗体 | Cell Signaling | 3033 | |
| 兔抗NF-κB p65抗体 | Cell Signaling | 8242 | |
| 兔抗肌动蛋白抗体 | Cell Signaling | 4967 | |
| HRP偶联二抗 | Jackson laboratories | 111-035-003 | |
| 增强化学发光底物 | GenDEPOT | W3651-012 | |
| 共聚焦显微镜 | LabTek II培养室 | Nalgene | 154526 |
| 牛血清白蛋白 | -- | -- | |
| Alexa594偶联抗小鼠TLR4抗体 | R&D Systems | 1203B | |
| DAPI | Vector Laboratories | H-1200-10 | |
| 共聚焦FV1000显微镜 | Olympus | FV1000 | |
| Triton X-100 | -- | -- | |
| 单分子pull-down | Amicon超滤管 | Merck Millipore | UFC500396 |
| 多聚赖氨酸 | Sigma Aldrich | P4707 | |
| 抗GFP抗体 | Abcam | ab5449 | |
| ELISA | TLR2重组蛋白 | Sino Biological | 10061-H08B |
| PolySorp微孔板 | Invitrogen™ | 44-2404-21 | |
| 小鼠抗His抗体 | Abcam | ab18184 | |
| HRP偶联抗小鼠IgG | Jackson ImmunoResearch | 115-035-003 | |
| TMB溶液 | -- | -- | |
| SPR | Biacore™ T200 | GE Healthcare | T200 |
| HMGB1分泌 | OPTI-MEM培养基 | Gibco™ | 31985070 |
| Centricon超滤管 | Merck Millipore | UFC500396 | |
| TNF-α测量 | ELISA试剂盒 | Invitrogen | 88-7324-88 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| HMGB1二聚化 | HMGB1浓度、LPS/LTA浓度、H2O2浓度、孵育时间、C106A突变体、NAC和DTT处理 阅读提示：Methods 2.4，图2 |
| 细胞培养和转染 | 细胞系、培养基、FBS浓度、抗生素、转染试剂、融合度 阅读提示：Methods 2.1 |
| 蛋白纯化 | 表达菌株、裂解方法、纯化柱、内毒素去除 阅读提示：Methods 2.3 |
| 免疫沉淀 | TLR4/MD2浓度、抗体、孵育时间 阅读提示：Methods 2.5，图4C |
| 结合分析 | TLR蛋白包被浓度、HMGB1浓度范围、SPR参数 阅读提示：Methods 2.8, 2.9，图4 |
| NF-κB信号 | 细胞系、处理时间、蛋白浓度、NAC/DTT浓度 阅读提示：Methods 2.5, Results 3.5，图5 |
| TNF-α产生 | 细胞密度、处理时间、蛋白浓度、NAC/DTT浓度 阅读提示：Methods 2.11, Results 3.6，图6 |
| 小鼠实验 | 小鼠品系、周龄、性别、LPS剂量、血清采集时间 阅读提示：Methods 2.12，图1B |