鉴定NRP1为呼肠孤病毒受体
验证CRISPR筛选中NRP1是否促进呼肠孤病毒感染。
在BV2细胞中敲除NRP1，检测T1L和T3D感染变化；在CHO细胞中过表达mNRP1等受体cDNA，检测病毒结合和感染。
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NRP1是哺乳动物正呼肠孤病毒的受体，由不同的衣壳亚基参与结合
NRP1 is a receptor for mammalian orthoreovirus engaged by distinct capsid subunits.
实验完整度
高包括细胞实验（CRISPR敲除、异源表达）、生物物理实验（AFM、BLI）、结构分析和动物模型（小鼠感染），并进行了功能验证和机制验证。
主要模型
小鼠小胶质细胞BV2细胞系 中国仓鼠卵巢（CHO）细胞 原代小鼠皮层神经元 新生C57BL/6J×129sv杂交小鼠
重点核对
mNRP1的表达和结合（流式细胞术） T3D和T1L株的特异性（基因片段交换） NRP1胞外域和衣壳蛋白的关键区域（嵌合体和突变体） 体内传播和神经毒力（颅内和肌肉注射）
摘要
哺乳动物正呼肠孤病毒（reovirus）是一种无包膜病毒，在肠道建立原发感染，并传播至继发感染部位，包括中枢神经系统。呼肠孤病毒的进入涉及多种结合因子，但病毒如何全身传播并靶向神经元仍不清楚。在本研究中，我们鉴定了鼠神经毡蛋白1（mNRP1）作为呼肠孤病毒的受体。mNRP1以纳摩尔亲和力结合呼肠孤病毒，利用一种独特的病毒-受体相互作用机制，该机制由不同的呼肠孤病毒衣壳亚基和多个NRP1胞外域之间的多重相互作用协调。通过交换必需的衣壳蛋白编码基因片段，我们确定了多价相互作用是由外衣壳蛋白σ3和衣壳塔蛋白λ2介导的。利用不能结合NRP1的衣壳突变体，我们发现NRP1有助于呼肠孤病毒在小鼠体内的传播和神经毒力。总之，我们的结果表明NRP1是呼肠孤病毒的进入受体，并揭示了NRPs促进病毒进入和发病机制的机制。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 哺乳动物正呼肠孤病毒如何系统性传播并靶向神经元？
- 核心机制
- NRP1作为呼肠孤病毒受体，通过外衣壳蛋白σ3和塔蛋白λ2与NRP1的a1、b1和b2域结合，介导病毒进入，促进传播和神经毒力。
- 主要证据
- 利用CRISPR敲除、异源表达、嵌合受体、基因片段交换、衣壳突变体、AFM和BLI等实验，证明mNRP1特异结合T3D株，且σ3和λ2的特定区域对结合至关重要；小鼠感染实验显示NRP1结合突变体减弱传播和神经毒力。
- 研究意义
- 揭示了NRPs在无包膜病毒进入和发病机制中的功能，为其他使用NRPs作为受体的病毒提供了研究模型，并可能有助于评估呼肠孤病毒的流行病学潜力和开发对策。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
生物物理表征病毒-NRP1相互作用
定量分析呼肠孤病毒与NRP1的结合亲和力和动力学。
使用沉淀实验验证病毒与重组NRP1结合；使用AFM在模型表面和活细胞上测量单分子结合力、动力学参数。
确定NRP1参与结合的胞外域
确定NRP1上的哪些胞外域与呼肠孤病毒结合。
构建鼠/人NRP1嵌合受体和缺失突变体，在CHO细胞中表达，检测病毒结合和感染。
确定病毒衣壳蛋白介导NRP1结合
确定呼肠孤病毒衣壳蛋白中与NRP1结合所需的组分。
使用反向遗传系统产生T1L×T3D重组病毒，交换基因片段，检测感染；制备ISVP，检测与mNRP1结合；表达σ3蛋白进行BLI分析。
突变λ2和σ3以构建NRP1结合缺陷病毒
验证λ2和σ3中的特定多态性残基对NRP1结合和感染的作用。
在T3D和T1L中引入λ2区域I/II和σ3斑块I-III的氨基酸替换，检测感染和结合能力。
评估NRP1在小鼠体内传播和神经毒力中的作用
确定NRP1是否影响呼肠孤病毒在体内的传播和神经毒力。
将野生型或NRP1结合突变病毒感染新生小鼠，通过颅内或肌肉途径接种，测定病毒滴度和生存率。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| CRISPR敲除 | lentiCRISPRv2-blast载体 | Addgene | Cat #52963 |
| 细胞培养 | TransIT-LT1转染试剂 | Mirus Bio | Cat #MIR2306 |
| Lipofectamine LTX转染试剂及PLUS试剂 | Thermo Fisher | Cat #12343593 | |
| 杀稻瘟菌素 | Invivogen | Cat #ant-bl-1 | |
| 遗传霉素选择性抗生素 | Thermo Fisher | Cat #10131035 | |
| 胰蛋白酶-EDTA (0.25%) | Thermo Fisher | Cat #25200114 | |
| 胎牛血清 | Thermo Fisher | Cat #S11550H | |
| DMEM培养基 | Thermo Fisher | Cat #11965118 | |
| Ham's F-12营养培养基 | Thermo Fisher | Cat #11765054 | |
| JMEM培养基 | United States Biological | Cat #M3867 | |
| Neurobasal培养基 | Thermo Fisher | Cat #21103049 | |
| B-27补充物 | Thermo Fisher | Cat #17504044 | |
| L-谷氨酰胺 | Thermo Fisher | Cat #A2916801 | |
| 青霉素-链霉素 | Thermo Fisher | Cat #15070063 | |
| 两性霉素B溶液 | Sigma-Aldrich | Cat #A2942-50ML | |
| Corning CellStripper解离试剂 | Fisher Scientific | Cat #MT25056CI | |
| 病毒标记 | Alexa Fluor 647 NHS酯 | Thermo Fisher | Cat #A37573 |
| 碳酸氢钠 | Fisher Scientific | Cat #BP328-500 | |
| 药物处理 | 弗林蛋白酶抑制剂I | Sigma-Aldrich | Cat #344930 |
| 弗林蛋白酶抑制剂II | Sigma-Aldrich | Cat #SCP0148 | |
| 二甲基亚砜 | Sigma-Aldrich | Cat #D2650 | |
| 沉淀实验 | Pierce蛋白G磁珠 | Thermo Fisher | Cat #88848 |
| SDS-PAGE | 2x Laemmli上样缓冲液 | Bio-Rad | Cat #1610737 |
| 4x Laemmli样品缓冲液 | Bio-Rad | Cat #1610747 | |
| Invitrogen胶体蓝染色试剂盒 | Thermo Fisher | Cat #LC6025 | |
| 组织学 | 二甲苯 | Sigma-Aldrich | Cat #534056 |
| 乙醇 | Fisher Scientific | Cat #200GMP0125 | |
| NucleoBond Xtra Midi EF质粒纯化试剂盒 | Takara Bio | Cat #740420.50 | |
| Polysciences Aqua-Poly/Mount封片剂 | Polysciences | Cat #18606 | |
| 福尔马林 | Fisher Scientific | Cat #SF100-4 | |
| AFM | 氯仿 | Sigma-Aldrich | Cat #288306-100ML |
| APTES | Sigma-Aldrich | Cat #A3648–100ML | |
| Ald-Ph-PEG24-NHS酯 | Broadpharm | Cat # BP-24093 | |
| 细胞培养 | Ham's F-12营养培养基（AFM实验） | Sigma-Aldrich | Cat #N4888-500ML |
| 青霉素-链霉素（AFM实验） | Sigma-Aldrich | Cat #P4333-100ML | |
| Normocin（AFM实验） | InvivoGen | Cat #ant-nr-1 | |
| 胎牛血清（AFM实验） | Fisher Scientific | Cat #11570506 | |
| 设备 | LSR II流式细胞仪 | BD | -- |
| Lionheart FX自动显微镜 | BioTek | -- | |
| TissueLyser LT组织研磨器 | QIAGEN | Cat #85600 | |
| 不锈钢珠 | QIAGEN | Cat #69989 | |
| Odyssey CLx成像仪 | LI-COR | -- | |
| 紫外臭氧清洗机 | Jetlight | -- | |
| ForceRobot300原子力显微镜 | JPK | -- | |
| NanoScope Multimode 8原子力显微镜 | Bruker | -- | |
| MSCT-D悬臂 | Bruker | -- | |
| Zeiss Observer Z.1倒置荧光显微镜 | Zeiss | -- | |
| Bioscope Resolve原子力显微镜 | Bruker | -- | |
| PFQNM-LC悬臂 | Bruker | -- | |
| 镀金模型表面 | Siegert Wafer Company (硅片) | -- | |
| 金粒 | Neyco | cat #AU3X6 | |
| OCTET BLI系统 | Sartorius | -- | |
| OCTET AR2G生物传感器 | Sartorius | -- | |
| OCTET NTA生物传感器 | Sartorius | -- | |
| 动物实验 | C57BL/6J小鼠 | The Jackson Laboratory | Cat #000664 |
| 129S4/SvJaeJ小鼠 | The Jackson Laboratory | Cat #009104 | |
| BD Luer-Lok注射器 | BD | Cat #309628 | |
| 30G注射针 | BD | Cat #305106 | |
| Hamilton注射器（型号702 LT SYR） | Hamilton Company | Cat #80401 | |
| 重组蛋白 | mNRP1-Fc | Sino Biological | Cat #50509-M38H |
| hNRP1-Fc | R&D Systems | Cat #10455-N1-050 | |
| mNRP1-His | Sino Biological | Cat #50509-M08H-50 | |
| hNRP1-His | Acro Biosystems | Cat #15817367 | |
| 鼠VEGF164 | Acro Biosystems | Cat #VE4-M4216 | |
| 人VEGF165 | Acro Biosystems | Cat #16408149 | |
| T3D σ3蛋白（大肠杆菌表达） | Cosmo Bio | Cat #CSB-EP365971RCHa0-20 | |
| T3D σ3蛋白（昆虫细胞表达） | Gentaur | Cat #GEN1097713 | |
| 抗体 | 大鼠抗小鼠NRP1单克隆抗体 | Biolegend | Cat #145202 |
| 小鼠抗人NRP1单克隆抗体 | Biolegend | Cat #354502 | |
| 大鼠PE抗小鼠NRP1单克隆抗体 | Biolegend | Cat #145204 | |
| PE大鼠IgG2a同型对照 | Biolegend | Cat #400508 | |
| 小鼠APC抗人NRP1单克隆抗体 | Biolegend | Cat #354505 | |
| 纯化大鼠IgG2a同型对照 | Biolegend | Cat #400502 | |
| 纯化小鼠IgG2a同型对照 | Biolegend | Cat #400202 | |
| 免疫荧光 | 山羊抗大鼠IgG二抗，Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher | Cat #A-11006 |
| 山羊抗小鼠IgG二抗，Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher | Cat #A-11029 | |
| 山羊抗兔IgG二抗，Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher | Cat #A-11034 | |
| 兔抗呼肠孤病毒多克隆抗体 | 实验室保存 | -- | |
| 质粒 | pCDNA3.1-mNRP1质粒 | 本研究 | -- |
| pCDNA3.1-hNRP1质粒 | 本研究 | -- | |
| pCMV3-mNRP2质粒 | Sino Biological | Cat #MG57465-UT | |
| pCDNA3.1-hNRP2质粒 | 本研究 | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 受体验证 | BV2细胞中NRP1敲除效率，病毒MOI（T1L 1000 PFU/cell，T3D 10 PFU/cell），感染时间（24 h） 阅读提示：Methods: CRISPR knockout, Reovirus infectivity assay |
| 病毒结合实验 | 病毒标记方法（Alexa Fluor 647），病毒量（2×10^5 virions/cell），吸附时间（4°C，1 h），细胞数量 阅读提示：Methods: Reovirus binding assay |
| AFM生物物理实验 | 悬臂类型（MSCT或PFQNM-LC），功能化试剂（APTES、PEG），病毒量（10^8 particles），加载率范围，接触时间系列 阅读提示：Methods: Functionalization of AFM tips, FD-based AFM using model surfaces, FD-based AFM and correlative imaging using living cells |
| BLI实验 | NRP1浓度（13, 26, 52 nM），固定σ3浓度（10 μg/ml），结合时间（20 min），解离时间（10 min） 阅读提示：Methods: Biolayer interferometry |
| 体内实验 | 小鼠品系（C57BL/6J×129sv杂交），年龄（2日龄），接种途径（颅内100 PFU/只；肌肉10^7 PFU/只），组织收集时间点（2, 4, 6, 8天），病毒滴度测定方法（噬斑实验） 阅读提示：Methods: Reovirus infections of mice |
| 神经元实验 | 神经元分离时间（E15.5胚胎），培养时间（7天），感染MOI（20 PFU/cell），感染时间（1 h），检测时间（24 h） 阅读提示：Methods: Reovirus infectivity assay |