验证JNK与BRD4的相互作用
确认JNK是否与BRD4直接结合并磷酸化BRD4
使用PLA、免疫共沉淀和体外pull-down实验证明JNK与BRD4结合；体外激酶实验确定磷酸化位点。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
JNK磷酸化切换BRD4的功能
Phosphorylation by JNK switches BRD4 functions.
实验完整度
高包含体外激酶实验、细胞模型（HCT116、DLD1、PC3）、ChIP-seq、RNA-seq、胸腺细胞激活和EMT诱导等多个独立证据层级，并进行了功能验证和机制验证。
主要模型
HCT116人结肠癌细胞系 DLD1-BRD4-IAA7人结肠癌细胞系 PC3人前列腺癌细胞系 小鼠胸腺细胞 体外重组蛋白系统
重点核对
BRD4 Thr1186和Thr1212的JNK磷酸化位点突变（3A-BRD4） JNK抑制剂SP600125和D-JNK-1的使用 Anisomycin或热休克激活JNK的条件 染色质结合与非结合组分的分离方法 JNK1/JNK2显性负性突变体的表达
摘要
Bromodomain 4 (BRD4), a key regulator with pleiotropic functions, plays crucial roles in cancers and cellular stress responses. It exhibits dual functionality: chromatin-bound BRD4 regulates remodeling through its histone acetyltransferase (HAT) activity, while promoter-associated BRD4 regulates transcription through its kinase activity. Notably, chromatin-bound BRD4 lacks kinase activity, and RNA polymerase II (RNA Pol II)-bound BRD4 exhibits no HAT activity. This study unveils one mechanism underlying BRD4's functional switch. In response to diverse stimuli, c-Jun N-terminal kinase (JNK)-mediated phosphorylation of human BRD4 at Thr1186 and Thr1212 triggers its transient release from chromatin, disrupting its HAT activity and potentiating its kinase activity. Released BRD4 directly interacts with and phosphorylates RNA Pol II, PTEFb, and c-Myc, thereby promoting transcription of target genes involved in immune and inflammatory responses. JNK-mediated BRD4 functional switching induces CD8 expression in thymocytes and epithelial-to-mesenchymal transition (EMT) in prostate cancer cells. These findings elucidate the mechanism by which BRD4 transitions from a chromatin regulator to a transcriptional activator.
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- BRD4如何从染色质调节因子切换为转录激活因子？其功能转换的分子机制是什么？
- 核心机制
- JNK介导的BRD4磷酸化（Thr1186和Thr1212）触发其从染色质释放，抑制其HAT活性，激活其激酶活性；释放的BRD4与Pol II、PTEFb和c-MYC相互作用并磷酸化，促进基因转录。
- 主要证据
- 体外激酶实验显示JNK直接磷酸化BRD4；细胞实验显示JNK激活导致BRD4从染色质释放并增加下游底物磷酸化；ChIP-seq和RNA-seq显示BRD4释放后全基因组分布变化和炎症基因表达上调。
- 研究意义
- 揭示了BRD4在应激反应中功能转换的调控机制，为靶向BRD4的治疗策略提供了新的视角。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
验证JNK磷酸化BRD4导致其从染色质释放
检验JNK激活是否导致BRD4从染色质释放
用anisomycin或热休克处理HCT116细胞，分离染色质结合和非结合组分，检测BRD4分布；使用SP600125和显性负性JNK突变体阻断。
验证磷酸化BRD4对核小体结合和HAT活性的影响
探究JNK磷酸化是否影响BRD4的核小体结合和HAT活性
使用体外核小体pull-down和HAT实验检测磷酸化BRD4对核小体结合和H3K122乙酰化的影响。
验证BRD4激酶活性的激活
检验JNK释放BRD4后其激酶活性是否增强
细胞经anisomycin处理后检测BRD4底物（CDK9, Pol II CTD, MYC）磷酸化水平。
转录组分析
确定JNK释放BRD4是否影响基因表达
RNA-seq分析anisomycin处理的WT和3A-BRD4转染细胞，鉴定差异表达基因。
体内验证：胸腺细胞激活和EMT
验证JNK介导的BRD4释放是否与胸腺细胞激活和EMT相关
刺激小鼠胸腺细胞和诱导PC3细胞EMT，检测BRD4磷酸化和染色质分布。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | -- | -- |
| F-12K培养基 | -- | -- | |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| 药物处理 | 茴香霉素 | GoldBio | -- |
| SP600125 | Selleckchem | -- | |
| D-JNK-1 | MedChemExpress | -- | |
| JQ1 | BPS Bioscience | -- | |
| 佛波醇12-十四酸酯13-乙酸酯 | Sigma | -- | |
| 离子霉素 | Sigma | -- | |
| 茴香霉素 | GoldBio | -- | |
| 蛋白纯化 | Flag珠子 | Sigma | -- |
| GST琼脂糖珠 | Sigma | -- | |
| Microcon尺寸排阻柱 | Millipore | -- | |
| Ni-NTA琼脂糖珠 | Qiagen | -- | |
| 蛋白质分析 | 抗BRD4抗体 | Bethyl | -- |
| 抗磷酸化JNK抗体 | Santa Cruz Biotechnology | -- | |
| 抗H3K122乙酰化抗体 | abcam | -- | |
| 抗MYC抗体 | abcam | -- | |
| 抗RNA聚合酶II抗体 | Santa Cruz Biotechnology | -- | |
| 激酶实验 | 重组人GST-JNK1 | SignalChem | -- |
| 重组人GST-JNK2 | SignalChem | -- | |
| 重组人His-JNK1 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 磷酸酶实验 | 重组人蛋白磷酸酶2A | Cayman Chemical | -- |
| 重组人蛋白磷酸酶PPP4C | MyBioSource | -- | |
| 免疫沉淀 | Dynabeads蛋白A磁珠 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| 核小体组装 | EpiMark核小体组装试剂盒 | New England Biolabs | -- |
| ChIP-seq | SimpleChIP Plus酶法染色质IP试剂盒 | Cell Signaling Technology | -- |
| AbFlex BRD4抗体 | Active Motif | -- | |
| RNA-seq | RNeasy Plus提取试剂盒 | Qiagen | -- |
| Illumina链特异性mRNA制备连接试剂盒 | Illumina | -- | |
| 质谱分析 | 胰蛋白酶/LysC | -- | -- |
| TMTpro试剂 | Thermo Fisher Scientific | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养 | 细胞系：HCT116、DLD1、PC3；培养基：DMEM（10% FBS）、F-12K（10% FBS）；培养条件：37°C，5%或7.5% CO2 阅读提示：STAR Methods, Cell Lines and Culture |
| 药物处理 | anisomycin浓度30 μg/ml，处理2小时；SP600125浓度未明确说明；D-JNK-1浓度未明确说明；JQ1浓度500 nM，处理18小时 阅读提示：STAR Methods, Transient transfections; Figure legends |
| 染色质分离 | 使用REAP方法分离核提取物；非染色质缓冲液含75mM NaCl，染色质缓冲液含350mM NaCl；分离步骤需严格按方案进行 阅读提示：STAR Methods, Non-chromatin and chromatin-bound protein fractionation |
| 激酶实验 | 激酶反应缓冲液（50mM Tris pH7.5, 5mM DTT, 5mM MnCl2, 5mM MgCl2）；ATP浓度（γ32P-ATP或40μM ATP）；反应时间60分钟，温度30°C 阅读提示：STAR Methods, In vitro Kinase assays |
| ChIP-seq | 使用DLD1-BRD4-IAA7细胞；auxin处理（500 μM）1小时；抗BRD4抗体（Active Motif） 阅读提示：STAR Methods, ChiP-seq analysis |