小鼠免疫与血清筛选
获得产生高滴度抗原特异性抗体的免疫小鼠。
使用编码狂犬病病毒RABV-G蛋白的mRNA疫苗（RABV-G mRNA-LNP）对BALB/cJGpt[GF]小鼠进行初免-加强免疫，初免与加强间隔一年半。通过ELISA筛选血清中抗原特异性抗体滴度最高的小鼠。
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利用Beacon平台从免疫小鼠中分离抗原特异性单克隆抗体的实验方案
Protocol for isolating antigen-specific monoclonal antibodies from immunized mice utilizing the Beacon platform.
实验完整度
中实验方法明确，包含细胞分离、芯片筛选、单细胞测序、克隆表达等环节，但缺少与对照组比较或功能验证的直接描述。
主要模型
小鼠脾脏来源的CD138+浆细胞 RABV-G mRNA-LNP免疫的BALB/cJGpt[GF]小鼠
重点核对
BALB/cJGpt[GF]小鼠，雌性，6-8周龄 使用EasySep Mouse CD138 Positive Selection Kit富集浆细胞 使用Beacon平台和OptoSelect Chip 11k芯片进行单细胞筛选 通过两轮巢式PCR扩增抗体VH和VL序列 使用FreeStyle 293-F细胞进行抗体表达
摘要
抗原特异性浆细胞的分离在Beacon平台问世之前一直充满挑战。Beacon利用光分选技术，能够在芯片上对浆细胞进行高通量筛选，以分选出具有所需抗原特异性的单细胞。在这里，我们提出了一种利用Beacon从免疫小鼠中分离抗原特异性浆细胞、对编码的B细胞受体（BCRs）进行测序、克隆和表达所得抗体的实验方案。该方案可以很容易地扩展到人类样本。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 如何利用Beacon平台从免疫小鼠中高效分离抗原特异性浆细胞并获取其抗体序列？
- 核心机制
- 文中未明确说明
- 主要证据
- 通过Beacon平台筛选，在两个芯片上分别鉴定出220和178个针对RABV-G蛋白的阳性单细胞。经过两轮巢式PCR，从46个单B细胞克隆中成功恢复20对重链和轻链，其中19对为天然配对。
- 研究意义
- 该方案提供了一种从免疫小鼠中分离抗原特异性浆细胞和获取单克隆抗体的方法，并声称可以轻松扩展到人类样本。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
浆细胞样品制备
从小鼠脾脏中制备单细胞悬液并富集CD138+浆细胞。
无菌分离小鼠脾脏，研磨制备单细胞悬液，使用EasySep Mouse CD138 Positive Selection Kit富集浆细胞。
检测抗原的生物素化
制备用于Beacon筛选的抗原包被检测微珠。
使用EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin将可溶性抗原（RABV-G蛋白）进行生物素化，然后包被到Assay Beads上。
Beacon平台芯片筛选
在Beacon平台的高通量芯片上筛选分泌抗原特异性抗体的浆细胞。
将富集的浆细胞加载到OptoSelect Chip 11k芯片上，利用OEP技术操作单细胞，通过荧光标记的检测抗体识别分泌抗原特异性抗体的阳性孔。
单细胞RNA提取与逆转录
获取单个阳性浆细胞的cDNA用于抗体序列扩增。
将Beacon分选出的阳性单细胞裂解，使用Agencourt RNAClean XP Kit纯化RNA，然后逆转录合成cDNA。
抗体序列的巢式PCR扩增
从单细胞cDNA中扩增抗体的重链和轻链可变区序列。
使用两轮巢式PCR扩增抗体VH和VL序列，第一轮PCR使用简并引物混合物，第二轮PCR使用特异性引物进行半巢式扩增。
抗体序列的克隆与测序
将扩增的抗体序列克隆到表达载体中并进行序列验证。
通过同源重组将重链和轻链序列克隆到表达载体中，转化DH5α感受态细胞，筛选阳性克隆并进行Sanger测序。
抗体表达与纯化
在哺乳动物细胞中表达并纯化抗体用于后续功能研究。
将重链和轻链质粒共转染至FreeStyle 293-F细胞，收集培养上清，通过Protein A/G亲和层析纯化抗体，并用SDS-PAGE分析纯度。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | RPMI培养基 | -- | -- |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| IMDM培养基 | Gibco | Cat#31980030 | |
| DMEM培养基 | Corning | Cat#10-013-CV | |
| 磷酸盐缓冲液 | Absin | Cat#abs962 | |
| PEI MAX 40K转染试剂 | Polysciences | Cat#24765 | |
| 富集浆细胞 | EasySep小鼠CD138阳性选择试剂盒 | STEMCELL Technologies | Cat#18957 |
| 免疫检测 | EZ-Link Sulfo-NHS-LC-生物素 | Thermo Scientific | Cat#A39257 |
| Beacon筛选 | Opto浆细胞B发现样品制备试剂盒（小鼠） | Berkeley Lights | Cat#750-02050 |
| OptoSelect芯片11k | Berkeley Lights | Cat#750-08090 | |
| 单细胞RNA提取 | TCL缓冲液（2×） | QIAGEN | Cat#1070498 |
| Agencourt RNAClean XP试剂盒 | Beckman Coulter | Cat#A63987 | |
| 逆转录 | SuperScript III逆转录酶 | Invitrogen | Cat#18080044 |
| RNaseOUT重组核糖核酸酶抑制剂 | Thermo Scientific | Cat#10777019 | |
| PCR | HotStarTaq DNA聚合酶 | QIAGEN | Cat#203203 |
| dNTP混合物（100 mM溶液） | Thermo Scientific | Cat#R0182 | |
| RNA逆转录 | 随机引物 | Invitrogen | Cat#48190011 |
| 克隆 | Wizard SV凝胶和PCR清洁系统 | Promega | Cat#A9282 |
| ClonExpress一步克隆试剂盒 | Vazyme | Cat#C112 | |
| FastDigest SalI限制酶 | Thermo Scientific | Cat#FD0644 | |
| Pfl23II (BsiWI)限制酶 | Thermo Scientific | Cat#ER0851 | |
| FastDigest AgeI (BshTI)限制酶 | Thermo Scientific | Cat#FD1464 | |
| DH5α化学感受态细胞 | Tsingke Biotech | TSC-C14 | |
| 质粒提取 | 无内毒素质粒小提试剂盒II | Omega Bio-tek | Cat#D6950-02 |
| NucleoBond Xtra Midi试剂盒EF | MACHEREY-NAGEL | Cat#740420.50 | |
| 抗体表达 | Gibco FreeStyle 293-F细胞 | Thermo Scientific | Cat#R79007 |
| 抗体纯化 | ÄKTA Pure蛋白纯化系统 | -- | -- |
| AbcapA/G 4FF层析柱 | Smart-Lifesciences | Cat#SA032C55 | |
| 抗体分析 | 180 kDa预染蛋白Marker | Vazyme | Cat#MP201 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 小鼠免疫 | 小鼠品系、性别、年龄；疫苗类型；免疫时间间隔；ELISA筛选标准 阅读提示：参见“Preparation 1: Mouse immunization and selection”部分 |
| 浆细胞制备 | 细胞浓度；富集试剂盒；操作时间 阅读提示：参见“Plasma cell sample preparation”部分 |
| Beacon筛选 | 芯片类型；细胞加载密度；检测抗体；成像时间 阅读提示：参见“Loading cells onto the beacon platform”和“On-chip screening of antigen-specific antibody-secreting cells”部分 |
| 单细胞RNA提取与逆转录 | RNA提取试剂；逆转录酶；反应条件 阅读提示：参见“Single-cell RNA purification and reverse transcription”部分 |
| 巢式PCR | 引物序列；退火温度；循环数 阅读提示：参见“Nested PCR amplification of antibody sequences-1st PCR”和“Nested PCR amplification of antibody sequences-2nd PCR”部分 |
| 抗体表达与纯化 | 表达细胞系；转染试剂；质粒比例；纯化方法 阅读提示：参见“Antibody-expressing plasmid purification and transfection”和“Antibody purification by affinity chromatography”部分 |