建立人iPSC神经元轴突变性模型
开发用于研究人类神经元损伤反应的可重复体外模型。
使用i3Neurons进行激光轴突切断，观察轴突变性和神经元死亡。
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DLK依赖性轴突线粒体分裂驱动轴突切断后的变性
DLK-dependent axonal mitochondrial fission drives degeneration after axotomy.
实验完整度
高包含人iPSC神经元体外模型、HEK293细胞异源系统、小鼠视神经挤压模型和患者数据（免疫荧光、Western blot、活体成像、质谱分析、电镜等）。
主要模型
人iPSC诱导的谷氨酸能神经元（i3Neurons） HEK-293A细胞 小鼠视网膜神经节细胞（RGC） 小鼠视神经挤压模型
重点核对
使用CRISPR/Cas9敲除DLK、SARM1，以及CRISPRi敲低DRP1的i3Neurons 激光轴突切断后，监测线粒体分裂、轴突变性指数（ADI）和神经元死亡 使用DLK抑制剂GNE3511、JNK抑制剂SP600125、DRP1抑制剂P110、BAX抑制剂BAI和激活剂BTSA1 免疫印迹检测pDRP1 S616、pDRP1 S637、总DRP1、p-cJun等蛋白水平 通过AAV递送saCas9和gRNA在体内敲低DRP1，评估视神经挤压后RGC存活
摘要
目前，对于一系列神经退行性疾病尚无有效治疗方法，这在很大程度上是因为基于细胞的模型无法重现疾病。在这里，我们开发了一个可重复的人iPSC模型，其中激光轴突切断导致逆行性轴突变性，进而导致神经元死亡。时间序列共聚焦成像显示，损伤会触发线粒体分裂的凋亡波，从损伤部位向胞体传播。我们证明这种凋亡波是由双亮氨酸拉链激酶（DLK）在轴突中局部启动的。我们发现线粒体分裂和由此产生的细胞死亡完全依赖于DLK下游的发动蛋白相关蛋白1（DRP1）的磷酸化，揭示了DLK驱动凋亡的一种机制。重要的是，我们表明CRISPR介导的Drp1耗竭可保护小鼠视网膜神经节神经元免受视神经挤压后的变性。我们的结果为研究人类神经元变性提供了一个平台，指出了损伤相关神经死亡的关键早期事件，并为治疗干预提供了潜在焦点。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- DLK信号通路在人类神经元轴突损伤后是否以及如何驱动轴突变性和神经元死亡？
- 核心机制
- DLK通过JNK磷酸化DRP1（S616），促进DRP1与BAX在轴突线粒体上的相互作用，触发凋亡性线粒体分裂，形成从损伤部位向胞体传播的凋亡波，最终导致轴突变性和神经元死亡。
- 主要证据
- 在i3Neurons中，激光轴突切断后观察到DLK依赖的DRP1 S616磷酸化、线粒体分裂、轴突变性和细胞死亡；DLK KO、DRP1 KD和BAX抑制剂均能保护轴突变性和神经元死亡。在HEK293细胞中，DLK过表达足以诱导DRP1 S616磷酸化和线粒体碎片化。在体内，视神经挤压后DRP1敲低显著减少RGC凋亡并增加存活。
- 研究意义
- 本研究揭示了一种不依赖转录的、由DLK驱动的轴突凋亡级联反应，为理解神经损伤和神经退行性疾病中的轴突变性提供了新机制，并指出DLK-DRP1-BAX轴可作为治疗干预的潜在靶点。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
评估SARM1在轴突变性中的作用
确定近端轴突变性是否依赖于SARM1。
使用CRISPR/Cas9敲除SARM1，比较轴突变性指数（ADI）。
观察损伤后线粒体分裂的动态变化
表征轴突损伤后线粒体分裂的空间和时间动态。
转染mitoGFP标记线粒体，进行活细胞成像，分析线粒体长度和数量变化。
验证DLK和JNK信号在分裂中的作用
测试DLK及其下游JNK是否为轴突损伤诱导的线粒体分裂所必需。
使用DLK KO神经元、DLK抑制剂GNE3511和JNK抑制剂SP600125，分析线粒体分裂。
验证DLK对DRP1磷酸化的作用
确定DLK是否直接或间接磷酸化DRP1并影响其功能。
在HEK-293A细胞中过表达DLK，检测DRP1 S616磷酸化水平；进行体外激酶实验和磷酸化质谱分析。
验证在体内和体外降低DRP1或DLK的保护作用
在人类神经元和小鼠模型中，测试抑制DLK或DRP1是否能保护轴突和神经元免受损伤。
在i3Neurons中敲低DRP1或使用BAX抑制剂，评估轴突变性和神经元存活；在小鼠中进行视神经挤压，通过AAV递送Cas9/gRNA敲低DRP1，评估RGC存活。
研究BAX在轴突变性和细胞死亡中的角色
确定BAX是否为DLK下游驱动轴突变性和神经元死亡的效应分子。
使用BAX抑制剂和激活剂，并检测BAX-DRP1相互作用（ddRFP系统）及线粒体定位。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
分子生物学和遗传学操作
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| iPSC分化 | Accutase | Life Technologies | A1110501 |
| Knockout DMEM/F12培养基 | Life Technologies Corporation | 12660012 | |
| N2补充剂 | Life Technologies | 17502048 | |
| GlutaMAX | Thermofisher Scientific | 35050061 | |
| MEM非必需氨基酸 | Thermofisher Scientific | 11140050 | |
| Y-27632 | Tocris | 1254 | |
| 多西环素 | Clontech | 631311 | |
| 多聚-L-鸟氨酸 | Sigma | P3655-10MG | |
| BrainPhys培养基 | STEMCELL Technologies | 05790 | |
| B27 Plus补充剂 | ThermoFisher Scientific | A3582801 | |
| BDNF | PeproTech | 450-02 | |
| NT-3 | PeproTech | 450-03 | |
| 小鼠层粘连蛋白 | Invitrogen | 23017015 | |
| 慢病毒生产 | Lenti-X HEK-293T细胞 | Takara Bio | 632180 |
| Lipofectamine 3000转染试剂 | ThermoFisher | L3000008 | |
| Opti-MEM I减血清培养基 | GIBCO | 31985070 | |
| ViralBoost | Alstem | VB100 | |
| Lenti-X浓缩液 | Takara Bio | 631231 | |
| 质粒克隆 | EYFP-DRP1 | Addgene | 45160 |
| In-fusion克隆 | Takara Bio | 638945 | |
| 轴突切断实验 | µ-Dish 35 mm培养皿 | Ibidi | 81156或81166 |
| Hybernate E培养基 | Gibco | A1247601 | |
| 药物处理 | GNE3511 | Sigma | 5331680001 |
| SP600125 | Selleckchem | S1460 | |
| P110 | Tocris | 6897 | |
| BAPTA-AM | Tocris | 2787 | |
| BTSA1（BAX激活剂） | Sigma | SML2243 | |
| BAI1（BAX抑制剂） | Medchemexpress | HY-103269 | |
| 免疫染色 | βIII微管蛋白抗体 | Thermo Fischer | 2G10 |
| pDRP1 S616抗体 | CST | 3455S | |
| DLK抗体 | Cell Signaling Technology | GF-23-1 | |
| TOM20抗体 | Santa Cruz | SC-17764 | |
| 钙成像 | Fluo-4 AM | ThermoFischer | F14201 |
| HEK细胞培养 | DMEM培养基 | Gibco | 11995065 |
| 胎牛血清 | Gibco | 10437028 | |
| 胰蛋白酶-EDTA（0.25%） | ThermoFischer | 25200056 | |
| Lipofectamine 2000转染试剂 | Invitrogen | 11668030 | |
| 蛋白质印迹 | RIPA裂解液 | Invitrogen | 89901 |
| 蛋白酶抑制剂 | Sigma | 11836153001 | |
| PhosStop磷酸酶抑制剂 | Sigma | 4906845001 | |
| BCA蛋白定量试剂盒 | ThermoFisher | 23225 | |
| 4–20% Mini-PROTEAN® TGX™预制蛋白胶 | Biorad | 4561095 | |
| Clarity Western ECL底物 | Biorad | 1705061 | |
| ChemiDoc MP成像系统 | Biorad | -- | |
| 抗DRP1抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-101270 | |
| 抗β肌动蛋白抗体 | Sigma | A1978 | |
| 抗p-cJun S63抗体 | CST | 9261 | |
| 抗pDRP1 S637抗体 | CST | 4867S | |
| Airyscan成像 | 德国玻璃盖玻片 | Electron Microscopy Sciences | 72290-04 |
| ProLong Glass抗淬灭剂 | Invitrogen | P36980 | |
| Seahorse分析 | Seahorse分析仪96孔板 | Agilent | 103774-100 |
| Seahorse XFe 96分析仪 | Agilent | -- | |
| 蛋白质纯化 | 谷胱甘肽-琼脂糖珠 | Sigma | GE17-0756-01 |
| SpinX离心柱 | Sigma | CLS8162-24EA | |
| 体外激酶测定 | 活性JNK1 | Signal chem biotech | M33-10G |
| DLK | Signal chem biotech | M20-11G | |
| DRP1 | Novus biochemical | H00010059 | |
| ATF2 | Signal chem biotech | A10-55G | |
| 磷酸化质谱分析 | Orbitrap Lumos质谱仪 | Thermo Scientific | -- |
| Easy-Spray离子源 | Thermo Scientific | -- | |
| ES902 Easy-Spray色谱柱 | Thermo Scientific | -- | |
| Ultimate 3000高效液相色谱仪 | Thermo Scientific | -- | |
| 电子显微镜 | JEOL-1400透射电子显微镜 | JEOL | -- |
| AMT BioSprint 29相机 | AMT | -- | |
| Aurion超小金标记F(ab′)2片段 | Electron Microscopy Sciences | -- | |
| Aurion R-Gent SE-EM银增强溶液 | Electron Microscopy Sciences | -- | |
| Pelco BioWave Pro微波炉 | Ted Pella, Inc. | -- | |
| Embed-812树脂 | Electron Microscopy Sciences | -- | |
| Leica EM UC7超薄切片机 | Leica | -- | |
| 生成DLK KO iPSCs | Cas9-GFP | -- | -- |
| gRNA表达质粒 | Sigma Aldrich | -- | |
| 嘌呤霉素 | Invitrogen | A11113803 | |
| 动物实验 | C57Bl/6J小鼠 | Jax | 000664 |
| 5%眼科聚维酮碘 | Henry Schein | 6900250 | |
| Opti-clear眼科洗眼液 | Akorn | NDC | |
| 0.5%丙美卡因滴眼液 | Henry Schein | 1365345 | |
| 5微升Hamilton注射器 | Hamilton | 7803-5 | |
| Vannas剪刀 | World Precision Instruments | 501777 | |
| 缝合镊 | Fine Science Tools | 1106307 | |
| Dumont镊子 | Fine Science Tools | 1125325 | |
| 免疫标记 | 抗cleaved caspase 3抗体 | CST | 9661 |
| Drop-n-Stain EverBrite™封片剂 | Biotium | 23008 | |
| 抗RBPMS抗体 | GeneTex | GTX118619 | |
| 驴抗兔Alexa 649二抗 | Jackson ImmunoResearch | 706-495-148 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| i3Neuron分化 | iPSC系（WTC11）、分化培养基成分、细胞因子浓度、培养时间 阅读提示：Methods: i3Neuron differentiation |
| 激光轴突切断 | 激光功率、迭代次数、培养皿类型、成像时间序列 阅读提示：Methods: Laser Axotomies |
| 线粒体分裂分析 | mitoGFP标记、药物处理浓度（GNE3511、JNKi、P110、BAPTA-AM）、成像频率和持续时间 阅读提示：Methods: Mitochondrial fission after axotomy |
| DRP1磷酸化检测 | Western blot抗体（pDRP1 S616）、轴突与胞体分离方法、损伤后时间点 阅读提示：Methods: Axon separation and axotomies; Western blotting |
| HEK293细胞实验 | DLK构建体（WT、C127S、S302A）、转染时间、DRP1 S616磷酸化检测 阅读提示：Methods: HEK cell culture and transfection; Western blotting |
| 小鼠视神经挤压实验 | AAV构建体（saCas9、gRNA）、病毒滴度、注射体积和时机、挤压后时间点 阅读提示：Methods: Adeno-associated virus (AAV); Intravitreal injections; Intra-orbital optic nerve crush (ONC) |
| BAX功能和相互作用分析 | BAX抑制剂浓度、BAX激活剂浓度、ddRFP构建体、荧光定量方法 阅读提示：Methods: Immunostaining of cells; Results: BAX mediates axon degeneration and cell death after axotomy |