构建GAS-NK报告细胞系
构建能够监测STAT1激活的NK细胞系。
利用pGF2-NFAT质粒为骨架，插入四拷贝GAS序列，包装慢病毒并感染NK-92细胞，经嘌呤霉素筛选获得GAS-NK细胞。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
STAT1作为癌症中NK细胞激活的非侵入性监测工具
STAT1 as a tool for non-invasive monitoring of NK cell activation in cancer.
实验完整度
高包括体外细胞共培养、3D球体、动物模型（肺癌转移模型）及患者来源类器官等多个独立实验层级，并包含功能验证（细胞毒性、细胞因子分泌）和机制验证（STAT1磷酸化、ChIP、RNA-seq）。
主要模型
NK-92细胞系（工程化GAS-NK细胞） K562血液癌细胞系 A549肺癌细胞系 SCID小鼠肺癌转移模型 患者来源癌症类器官（SNU-1, SNU-977, SNU-1181）
重点核对
IFNα处理浓度：5000 IU/mL 共培养效靶比（E:T）：1:1 GAS-NK细胞注射剂量：5×10^6细胞/小鼠 D-荧光素注射剂量：150 mg/kg A549肺癌转移模型建立：2×10^6或5×10^6细胞静脉注射
摘要
自然杀伤（NK）细胞因其天然靶向并破坏癌细胞的能力，在癌症免疫治疗中发挥着至关重要的作用。然而，目前用于在活体生物中可视化NK细胞抗肿瘤活性的方法有限。我们介绍一种成像方法，通过STAT1蛋白非侵入性地追踪癌细胞激活的NK细胞。为实现这一目标，我们对NK细胞进行改造，使其包含一个在激活时与STAT1结合的特定基因序列。这些工程化的NK细胞（GAS-NK）通过各种生物学测试和分析证明其功能性。对癌症环境变化和患者来源的癌症类器官模型的观察进一步证实了该方法的有效性。我们的方法提供了一种监测NK细胞活性的途径，这可能改善NK细胞为基础的癌症疗法的预测和有效性，为癌症治疗的进展做出贡献。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 如何选择性监测体内外NK细胞的激活状态，以预测NK细胞疗法的疗效？
- 核心机制
- 通过STAT1激活介导的GAS序列响应，驱动报告基因（GFP和荧光素酶）表达，实现NK细胞激活的特异性监测。
- 主要证据
- GAS-NK细胞在IFNα刺激或与癌细胞共培养时，报告基因表达增强；在肺癌转移模型中，GAS-NK细胞在肿瘤部位特异性激活；与患者来源类器官共培养显示激活差异。
- 研究意义
- 该方法可作为一种生物标志物，用于区分NK细胞疗法的响应者和非响应者，有助于预测疗效和筛选有效的NK细胞治疗候选方案。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
验证IFNα诱导的GAS-NK细胞激活
验证IFNα能否激活GAS-NK细胞并增强报告基因表达。
用IFNα处理GAS-NK细胞，检测荧光素酶活性、GFP表达、STAT1磷酸化及细胞因子分泌。
评估GAS-NK细胞与癌细胞共培养的激活
评估GAS-NK细胞在共培养中能否被癌细胞激活并监测。
将GAS-NK细胞与K562或A549等癌细胞共培养，检测报告基因活性和细胞毒性标志物。
评估TGFβ对GAS-NK细胞激活的抑制
评估肿瘤微环境中的TGFβ对GAS-NK细胞激活的影响。
用TGFβ处理GAS-NK细胞（有或无IFNα预刺激），检测GFP和荧光素酶活性。
体内监测GAS-NK细胞在肺癌转移模型中的激活
验证GAS-NK细胞在体内肿瘤部位的激活和靶向能力。
将A549细胞静脉注射SCID小鼠建立肺癌转移模型，随后注射GAS-NK细胞，通过生物发光成像监测激活，并分析肺组织NK细胞标志物。
验证GAS-NK细胞在患者来源类器官中的激活
评估GAS-NK细胞在患者来源肿瘤类器官中的激活情况。
将GAS-NK细胞与患者来源的结肠癌、胃癌等类器官共培养，检测GFP荧光和CD107a表达。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | α-MEM培养基 | -- | -- |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| 马血清 | -- | -- | |
| 重组人IL-2 | Peprotech | 200-02 | |
| DMEM培养基 | -- | -- | |
| EMEM培养基 | -- | -- | |
| RPMI-1640培养基 | -- | -- | |
| e-Myco PLUS支原体PCR检测试剂盒 | iNtRON Biotechnology | 25237 | |
| 细胞系构建 | pGreenFire2-NFAT质粒 | System Biosciences | , |
| Trans-DUX MAX转染试剂 | System Biosciences | -- | |
| 嘌呤霉素 | -- | -- | |
| pGEM-IFNα载体 | Sino Biological Inc | HG12341-G | |
| G418 | -- | -- | |
| 3D球体培养 | CellCarrier Spheroid ULA 96孔微板 | PerkinElmer | -- |
| 类器官培养 | L-WRN条件培养基 | -- | -- |
| 人EGF | -- | -- | |
| 人FGF-10 | -- | -- | |
| 烟酰胺 | -- | -- | |
| N-乙酰半胱氨酸 | -- | -- | |
| A83-01 | -- | -- | |
| SB202190 | -- | -- | |
| 前列腺素E2 | -- | -- | |
| N2补充剂 | -- | -- | |
| 显微镜成像 | CD45-PE抗体 | Beckman Coulter | A07783 |
| IBIDI腔室玻片 | Ibidi | -- | |
| 共聚焦显微镜LSM 710 | Carl Zeiss | -- | |
| ZOE荧光细胞成像仪 | Bio-Rad | -- | |
| Leica LMD6系统 | Leica | -- | |
| 流式分析 | CytoFlex流式细胞仪 | Beckman Coulter | -- |
| Astrios细胞分选仪 | Beckman Coulter | -- | |
| Kaluza软件 | Beckman Coulter | -- | |
| 人CD56抗体 | -- | -- | |
| RIPA裂解液 | Sigma | 20188 | |
| 胶原酶A | Roche | 10103586001 | |
| 透明质酸酶 | TCI | H0164 | |
| 脱氧核糖核酸酶I | Sigma | 11284932001 | |
| 蛋白酶抑制剂混合物 | Sigma | P8340 | |
| 报告基因检测 | 荧光素酶检测试剂盒 | Promega | -- |
| 动物成像 | D-荧光素 | PerkinElmer | -- |
| 9.4T动物磁共振成像系统 | Bruker Biospin | -- | |
| 免疫印迹 | STAT1抗体 | Cell Signaling Technology | 14994S |
| Phospho-Stat1-S727抗体 | Cell Signaling Technology | 8826S | |
| Phospho-Stat1-Y701抗体 | Cell Signaling Technology | 9167S | |
| β-actin抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-47778 | |
| HRP偶联二抗 | GeneTex | GTX213110-01 | |
| 蛋白酶抑制剂片 | Roche | -- | |
| iBlot干转印系统 | Invitrogen | -- | |
| iBind Western系统 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| ChemiDoc XRS+成像系统 | Bio-Rad | -- | |
| 细胞因子阵列 | Proteome Profiler人XL细胞因子阵列试剂盒 | R&D Systems | ARY022B |
| ELISA | VeriKine人IFNα ELISA试剂盒 | R&D Systems | -- |
| RNA提取 | TRIzol试剂 | -- | -- |
| cDNA合成 | SuperScript III第一链合成系统 | Invitrogen | -- |
| RNA测序 | NanoDrop 2000/2000c分光光度计 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| RNA测序 | ATG Lifetech Inc. | -- | |
| 数据分析 | GraphPad Prism 9.4.1 | -- | -- |
| GSEA_Linux_4.0.3 | -- | -- | |
| DESeq2 1.4.5 | -- | -- | |
| pheatmap 1.0.8 | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| GAS-NK细胞构建 | 转染试剂、慢病毒包装、嘌呤霉素筛选浓度及时间 阅读提示：Materials and methods: Cell line production |
| IFNα刺激GAS-NK细胞 | IFNα浓度（5000 IU/mL）、处理时间（24小时） 阅读提示：Results: Selective monitoring...; Figure 1b-d |
| 共培养激活GAS-NK | 效靶比（1:1）、共培养时间（24小时） 阅读提示：Results: Enhanced cytotoxic markers...; Figure 3c-e |
| TGFβ抑制实验 | TGFβ浓度（5或10 ng/mL） 阅读提示：Results: Differential activation...; Figure 5a-b |
| 体内肺癌转移模型 | A549细胞量、GAS-NK细胞量、D-荧光素剂量、成像时间点 阅读提示：Materials and methods: In vivo imaging analysis; Results: GAS-NK cell targeting... |