Endogenous interactomes of MFN1 and MFN2 provide novel insights into interorganelle communication and autophagy.
包含CRISPR-Cas9内源标签细胞系构建、质谱相互作用组鉴定、相互作用验证（免疫共沉淀）、功能缺失/恢复实验（RAB5C KO、SLC27A2 KD/KO）以及体内外的功能验证（自噬通量、线粒体形态），多层次验证机制。
HeLa细胞（ATCC CCL-2） CRISPR-Cas9基因编辑的MFN1-HA和MFN2-HA HeLa细胞系 RAB5C敲除HeLa细胞系 SLC27A2敲低和敲除HeLa细胞系
CRISPR-Cas9插入HA标签后MFN1和MFN2的表达水平与野生型一致，且部分敲入（MFN1 50%未结合，MFN2 20%未结合） RAB5C敲除导致MFN1、TOMM20、VDAC1、TIMM44蛋白水平下降，但mRNA水平不变 SLC27A2敲低或敲除后，饥饿诱导的LC3B-II自噬通量减少约50% RAB5C突变体（W75A,R82A,Y83A,Y90A）与MFN1的相互作用减弱 MFN2敲低不影响ATG5点状结构，但减少WIPI2和ATG2A点状结构
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
在不改变内源表达水平的前提下，为MFN1和MFN2附加HA标签，以便进行内源性免疫沉淀和相互作用鉴定。
使用CRISPR-Cas9和单链寡核苷酸在HeLa细胞MFN1和MFN2基因C端插入HA标签；通过Western blot验证蛋白质表达水平（MFN1、MFN2、OPA1、VDAC1），HA-IP评估标签整合效率，共聚焦显微镜分析线粒体形态，并通过EBSS处理验证自噬诱导和线粒体高融合反应。
在基础和饥饿条件下，全面鉴定MFN1和MFN2的内源结合伙伴，揭示营养状态对相互作用组的影响。
对MFN1-HA、MFN2-HA细胞和WT对照进行HA亲和分离，利用Orbitrap Fusion Lumos质谱仪进行LC-MS/MS分析，使用SAINTexpress算法进行显著性分析（BFDR≤0.05，FC≥3），比较基础和1小时EBSS饥饿条件下的相互作用因子。
确认质谱筛选出的候选相互作用蛋白，特别是来自内体和内质网的蛋白，是否真实与MFN1或MFN2结合。
在HeLa细胞中过表达FLAG标记的候选蛋白（RAB5C、NDFIP2、S100A8、S100A9、SLC27A2），进行FLAG免疫沉淀，通过Western blot检测MFN1或MFN2是否共沉淀。
探究RAB5C缺失是否影响线粒体蛋白表达、形态和降解，从而明确MFN1-RAB5C相互作用的生物学功能。
生成RAB5C KO HeLa细胞，通过Western blot检测多种线粒体蛋白（MFN1、TOMM20、VDAC1等）表达水平；通过共聚焦显微镜评估线粒体形态；使用MitoTracker Green和mtDNA染色测量线粒体质量；通过巴弗洛霉素A1处理和pSu9-Halo-mGFP报告细胞评估线粒体降解和自噬通量；进行回补实验验证表型特异性。
确定RAB5C中与MFN1直接相互作用的具体氨基酸残基。
使用ColabFold（AlphaFold2 Multimer）预测RAB5C与MFN1/MFN2的相互作用模型，识别参与结合的残基（Trp75、Arg82、Tyr83、Tyr90）；构建这些残基突变的RAB5C突变体，并在MFN1-HA细胞中过表达后进行HA-IP，检测突变体是否影响与MFN1的结合。
明确SLC27A2是否参与自噬体形成，并确定其在自噬通路中的具体步骤及其与MFN2的功能关系。
通过siRNA或CRISPR-Cas9敲低/敲除SLC27A2，评估自噬通量（LC3B-II）、自噬体数量（LC3 puncta、mCherry-GFP-LC3报告细胞）以及自噬早期标志物（ATG5、WIPI2、ATG2A）的点状结构；通过FLAG-IP检测SLC27A2与自噬相关蛋白（ATG16L1、LC3B、GABARAP、ATG2A、ATG2B）的相互作用；进行亚细胞分离富集自噬体，检测SLC27A2和MFN2的分布；通过共定位分析评估MFN2和SLC27A2对自噬体定位的相互依赖。
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Gibco | 41966-029 |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| 青霉素-链霉素 | Life Technologies | 15140122 | |
| 诱导自噬 | EBSS培养基 | Gibco | 24010043 |
| 抑制自噬溶酶体降解 | 巴弗洛霉素A1 | Santa Cruz Biotechnology | sc-201550 |
| 线粒体染色 | MitoTracker Green | ThermoFisher Scientific | M7514 |
| CRISPR-Cas9基因编辑 | pSpCas9(BB)-2A-Puro (PX459)载体 | Addgene | 48138 |
| RAB5C CRISPR/Cas9敲除载体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-403247 | |
| RAB5C HDR载体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-403247-HDR | |
| SLC27A2 CRISPR/Cas9敲除载体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-405122 | |
| SLC27A2 HDR载体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-405122-HDR | |
| 病毒包装 | pMRX-IB-pSU9-HaloTag7-mGFP载体 | Addgene | 184905 |
| pBabe-puro-mCherry-GFP-LC3载体 | Addgene | 22418 | |
| 聚乙烯亚胺 | -- | -- | |
| 病毒过滤 | 0.45微米滤膜 | Millipore | HAWP04700F1 |
| 抗生素筛选 | 嘌呤霉素 | Sigma-Aldrich | P7255 |
| 杀稻瘟菌素 | Merck | 203350 | |
| 蛋白质过表达 | FLAG-RAB5C | Sino Biological | HG15817-NF |
| S100A8-FLAG | Sino Biological | HG11138-NF | |
| S100A9-FLAG | Sino Biological | HG11145-NF | |
| SLC27A2-FLAG | Sino Biological | HG13155-NF | |
| 免疫沉淀 | HA偶联磁珠 | Pierce/Thermo Fisher Scientific | 88837 |
| FLAG偶联磁珠 | Thermo Fisher Scientific | A36797 | |
| 蛋白质检测 | RIPA裂解液 | -- | -- |
| Pierce BCA蛋白定量试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | 23225 | |
| Immobilon-P PVDF膜 | Millipore | IPVH00010 | |
| Immobilon-FL PVDF膜 | Millipore | IPFL07810 | |
| 吐温-20 | Sigma-Aldrich | P1379 | |
| Pierce ECL蛋白质印迹底物 | Thermo Fisher Scientific | RPN2106 | |
| Li-COR Odyssey FC成像系统 | Li-COR | -- | |
| Li-COR Odyssey红外成像系统 | Li-COR | -- | |
| Image Studio Lite软件 | Li-COR | -- | |
| 免疫荧光 | Hoechst 33342 | Thermo Fisher Scientific | H3570 |
| Fluoromount封片剂 | Sigma-Aldrich | F4680 | |
| 质谱分析 | Orbitrap Fusion Lumos三合一质谱仪 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| Advion Triversa Nanomate纳喷源 | Advion BioSciences | -- | |
| 胰蛋白酶 | Promega | V5111 | |
| 基因表达检测 | RNeasy提取试剂盒 | Qiagen | 74104 |
| qScript cDNA SuperMix | Quantabio | 733-1176 | |
| SYBR Green主混合物 | Applied Biosystems | 330520 | |
| ABI Prism 7900 HT实时PCR仪 | Applied Biosystems | -- | |
| SYBR Green PCR主混合物 | Applied Biosystems | 4367659 | |
| 自噬体分离 | Nycodenz | Axis-Shield/Serumwerk | 18003 |
| 蔗糖 | Sigma-Aldrich | S9378 | |
| 玻璃匀浆器和特氟龙杵 | Sigma-Aldrich | P7859 | |
| 细胞处理 | 巴弗洛霉素A1 | Santa Cruz Biotechnology | sc-201550 |
| 蛋白表达 | FLAG-RAB5C | Sino Biological | HG15817-NF |
| SLC27A2-FLAG | Sino Biological | HG13155-NF | |
| RAB5C突变体（W75A,R82A,Y83A,Y90A） | Genscript | -- | |
| SLC27A2片段 | Genscript | -- | |
| 数据分析 | SAINTexpress-spc | -- | -- |
| ProHits | -- | -- | |
| ImageJ软件 | -- | -- | |
| GraphPad Prism 8.0 | GraphPad Software | -- |
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养和处理 | 细胞系来源（HeLa ATCC CCL-2），培养基组成（DMEM、20 mM HEPES、10% FBS、100 U/ml青霉素-链霉素），EBSS处理时间（1小时）和巴弗洛霉素A1浓度（200 nM） 阅读提示：Materials and methods: Cell culture procedures and cell treatments |
| 生成MFN1-HA和MFN2-HA细胞系 | gRNA序列、ssODN序列、转染方法、单克隆筛选流程、HA标签插入验证（Western blot和基因组测序） 阅读提示：Materials and methods: Cell line generation |
| HA免疫沉淀和质谱 | 裂解缓冲液（1% digitonin）、HA磁珠品牌、质谱仪器（Orbitrap Fusion Lumos）、SAINTexpress参数（BFDR≤0.05，FC≥3） 阅读提示：Materials and methods: Immunoprecipitation, Mass spectrometry analysis |
| RAB5C功能研究 | RAB5C KO细胞系构建（Santa Cruz载体）、线粒体蛋白检测（TOMM20, VDAC1等）、线粒体形态分析（分类标准）、MitoTracker Green浓度（100 μM）和染色时间（30分钟）、巴弗洛霉素A1处理时间（4小时） 阅读提示：Figure legends 4 and 5, Materials and methods |
| SLC27A2自噬功能研究 | siRNA序列（SASI_Hs02_00330014等）和浓度（30 nM）、转染时间（48小时）、EBSS处理时间（1小时）、LC3B-II通量计算（EBSS±Baf A1）、mCherry-GFP-LC3报告细胞 阅读提示：Figure legend 7, Materials and methods: Transient gene downregulation |
