CNTN2全长蛋白的表达与纯化
获取用于结构与功能研究的全长人源CNTN2蛋白。
在HEK293F细胞中瞬转表达带有6×His-Myc标签的CNTN2（残基29-1012），经Ni-NTA亲和层析和Superose 6 increase 10/300凝胶过滤纯化。
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全长人源Contactin-2的冷冻电镜结构
Cryo-EM structures of the full-length human contactin-2.
实验完整度
高包含冷冻电镜结构解析、沉降速度分析、凝胶过滤、pull-down、细胞粘附实验及结构引导突变分析等多个独立验证层级。
主要模型
HEK293F细胞 全长人源CNTN2重组蛋白
重点核对
CNTN2全长成熟蛋白的浓度范围：0.04-3.57 mg/mL，用于凝胶过滤和SV-AUC实验 CNTN2蛋白浓度：1 mg/mL，用于冷冻电镜制样 细胞粘附实验中HEK293F细胞转染密度：2×10^7 cells，培养于SMM培养基，37°C，5% CO2，120 rpm，转染48小时 关键突变：L330E, R355A, R432A, R480A, R506A, R355/432/480/506A，影响二聚化界面 统计分析：细胞聚集实验重复两次，每次至少计数500个细胞，采用单因素方差分析比较野生型和突变组
摘要
Contactin-2（CNTN2）是一种在神经细胞表面表达的免疫球蛋白细胞粘附分子（IgCAM），调节髓鞘的形成，促进神经元与轴突胶质细胞之间的通讯，并协调神经细胞的迁移。然而，全长CNTN2的组装尚未完全阐明。在这里，我们发现全长人源CNTN2形成浓度依赖的同源二聚体。我们进一步解析了全长CNTN2的冷冻电镜结构，揭示了一个由两个原聚体的Ig1-6重复序列构成的新型蝶结状支架，柔性的带状FNIII重复序列向相反方向延伸。Ig1-6结构域而非先前提出的Ig1-4结构域在介导CNTN2依赖的细胞粘附和聚集方面具有不可或缺的作用。此外，结构引导的诱变分析支持了我们的结构中观察到的CNTN2同源二聚化对细胞粘附至关重要的观点。我们的发现为CNTN2在神经系统中形成同源二聚体以维持细胞间接触的机制提供了新的见解。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 全长人源CNTN2如何组装形成同源二聚体，以及哪些结构域和关键残基参与介导细胞粘附？
- 核心机制
- CNTN2通过Ig3-6重复序列形成相互交锁的蝶结状同源二聚体，其中Ig4重复提供大部分界面接触，而Ig1-4结构域不参与二聚化；该二聚化对CNTN2介导的细胞粘附至关重要。
- 主要证据
- 冷冻电镜结构显示全长CNTN2形成浓度依赖的对称二聚体（C2对称，分辨率3.3 Å），界面由Ig3-6重复介导；沉降速度分析和凝胶过滤证实浓度依赖的二聚化；结构引导突变（如L330E、R355A、R506A）破坏二聚化并显著降低细胞聚集。
- 研究意义
- 研究揭示了CNTN2通过同源二聚化维持神经系统中细胞间接触的分子机制，为理解CNTN2在神经发育和疾病中的作用提供结构基础。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
冷冻电镜结构解析
确定全长CNTN2的三维结构及其二聚化界面。
纯化的CNTN2在1 mg/mL浓度下制备冷冻样品，收集5802张显微照片，使用cryoSPARC和RELION进行数据处理，最终获得C2对称和C1对称的密度图，并搭建原子模型。
溶液中寡聚状态分析
验证CNTN2在溶液中的浓度依赖性二聚化。
利用沉降速度分析超速离心和凝胶过滤色谱评估不同浓度下CNTN2的寡聚状态。
二聚化界面的生化验证
通过突变关键界面残基检验其是否影响CNTN2二聚化。
对界面残基（L330E, R355A, R432A, R480A, R506A及组合突变）进行凝胶过滤和pull-down实验，评估突变对二聚化的影响。
细胞粘附实验
评估CNTN2不同结构域和突变对细胞粘附功能的影响。
将全长CNTN2、Ig1-4、Ig1-6、FNIII结构域以及关键突变体转染HEK293F细胞，通过显微镜观察细胞聚集和定位。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 蛋白表达与纯化 | pSecTag2B载体 | -- | -- |
| Q5 DNA聚合酶 | New England Biolabs | -- | |
| FreeStyle HEK293-F细胞 | Thermo Fisher | R79007 | |
| SMM培养基 | Bino Biological Inc. | -- | |
| Ni-NTA磁珠 | -- | -- | |
| Superose 6 increase 10/300凝胶过滤柱 | GE Healthcare | -- | |
| 冷冻电镜制样 | Quantifoil CF-400 1.2/1.3载网 | Quantifoil | -- |
| 冷冻电镜数据收集 | FEI Titan Krios G3i透射电镜 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| K3探测器 | Gatan | -- | |
| 冷冻电镜数据处理 | cryoSPARC软件 | -- | -- |
| RELION软件 | -- | -- | |
| 超速离心 | Optima AUC-A/I超速离心机 | Beckman Coulter | -- |
| 细胞粘附实验 | GFPSpark标签 | Sino Biological Company | HG10457-ACG |
| Q5定点突变试剂盒 | New England Biolabs | -- | |
| 多聚-L-赖氨酸 | -- | -- | |
| DiD染料 | Beyotime | C1995S | |
| DAPI染料 | Invitrogen | D1306 | |
| ZEISS LSM 980共聚焦显微镜 | ZEISS | -- | |
| Pull-down实验 | 抗DYKDDDDK G1亲和树脂 | -- | -- |
| 3×FLAG肽 | -- | -- | |
| SDS-PAGE | 考马斯亮蓝 | Absbio | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 蛋白表达与纯化 | CNTN2表达质粒的构建（pSecTag2B载体，C端6×His-Myc标签），HEK293F细胞浓度，转染效率，培养时间（5天），纯化缓冲液（20 mM HEPES pH 7.5, 150 mM NaCl, 300 mM imidazole） 阅读提示：Materials and methods - Protein expression and purification |
| 冷冻电镜结构解析 | CNTN2蛋白浓度（1 mg/mL），制样缓冲液（20 mM HEPES pH 7.5, 150 mM NaCl, 0.01% LMNG），网格类型（Quantifoil CF-400 1.2/1.3），电镜参数（电压300 kV，像素大小0.92 Å，总剂量50 e/Å2），数据处理软件（cryoSPARC, RELION） 阅读提示：Materials and methods - Cryo-EM sample preparation and data collection; Table 1 |
| 溶液中寡聚状态分析 | SV-AUC浓度（3.8, 1.5, 0.5 mg/mL）及离心条件（20°C, 280 nm/250 nm, 128,822 g, AN 60 Ti rotor），凝胶过滤浓度范围（0.04-3.57 mg/mL） 阅读提示：Materials and methods - Analytical ultracentrifugation; Table 2; Figure 1D,E |
| 二聚化界面的生化验证 | 突变位点（L330E, R355A, R432A, R480A, R506A, R355/432/480/506A），凝胶过滤和pull-down实验条件（FLAG标签和GFP标签） 阅读提示：Results - Biochemical validation of CNTN2 dimerization; Figure 2F,G |
| 细胞粘附实验 | 转染的CNTN2构建（全长、Ig1-4, Ig1-6, FNIII以及突变体），细胞密度（2×10^7），培养基（SMM），培养时间（48小时），细胞聚集观察时间（1小时），使用显微镜（ZEISS LSM 980），聚集量化方法（Fiji ImageJ） 阅读提示：Materials and methods - Cell adhesion assay; Figure 5 and 6 |