开发DISP裂解缺陷小鼠模型并表征表型
确定DISP裂解对神经发育的必要性。
利用CRISPR-Cas9生成Disp1CS和Disp1INDEL等位基因，观察胚胎和出生后小鼠的生长、存活、脑部形态和运动行为。
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细胞丝足信号对哺乳动物组织模式形成提供必要贡献
Cytoneme signaling provides essential contributions to mammalian tissue patterning.
实验完整度
高包含体外细胞实验、类器官球体、小鼠遗传模型和体内影像学等多层级验证，并明确功能与机制验证。
主要模型
小鼠神经管 DispKO小鼠胚胎成纤维细胞 IMCD3多细胞球体 MDCK细胞单层
重点核对
Disp1CS/INDEL小鼠的生存率和神经管模式 SHH-LightII报告基因实验验证SHH信号活性 Ca2+通量实验验证细胞丝足介导的信号传递 体内细胞丝足成像（SHH-Cre;mT/mG和ShhGFP） Myo10m1J/m1J小鼠的细胞丝足长度和密度
摘要
During development, morphogens pattern tissues by instructing cell fate across long distances. Directly visualizing morphogen transport in situ has been inaccessible, so the molecular mechanisms ensuring successful morphogen delivery remain unclear. To tackle this longstanding problem, we developed a mouse model for compromised sonic hedgehog (SHH) morphogen delivery and discovered that endocytic recycling promotes SHH loading into signaling filopodia called cytonemes. We optimized methods to preserve in vivo cytonemes for advanced microscopy and show endogenous SHH localized to cytonemes in developing mouse neural tubes. Depletion of SHH from neural tube cytonemes alters neuronal cell fates and compromises neurodevelopment. Mutation of the filopodial motor myosin 10 (MYO10) reduces cytoneme length and density, which corrupts neuronal signaling activity of both SHH and WNT. Combined, these results demonstrate that cytoneme-based signal transport provides essential contributions to morphogen dispersion during mammalian tissue development and suggest MYO10 is a key regulator of cytoneme function.
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 细胞丝足在哺乳动物组织模式形成中是否以及如何贡献于形态发生素的运输？
- 核心机制
- DISP的Furin裂解促进SHH刺激的AP2依赖性内吞循环，使SHH加载到细胞丝足中，从而介导形态发生素的直接运输。
- 主要证据
- Disp1CS/INDEL小鼠中SHH从细胞丝足中耗竭导致神经管模式缺陷；Myo10缺失减少细胞丝足长度和密度，并削弱SHH和WNT信号。
- 研究意义
- 该研究表明细胞丝足介导的信号运输是形态发生素扩散的必要补充机制，并为细胞丝足功能提供了新的调控因子MYO10。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
体外DISP内吞循环机制研究
探究DISP裂解是否影响SHH刺激的内吞循环。
在DispKO MEF和IMCD3球体细胞中表达DISPWT或DISPCS，并使用共定位分析、生物素化实验和Dronpa3标记追踪内化动力学。
检测DISP裂解对SHH细胞丝足进入和信号活性的影响
验证DISP裂解是否促进SHH进入细胞丝足并增强信号传递。
在DispKO MEF中表达DISPWT或DISPCS，测量细胞丝足中SHH和DISP的荧光强度比，并通过SHH LightII报告基因和钙通量实验评估信号活性。
体内细胞丝足成像和SHH定位分析
证明细胞丝足携带SHH并在体内存在于神经管中。
开发组织固定和染色方案，使用SHH-Cre;mT/mG小鼠标记SHH表达细胞，通过共聚焦、SEM和SBF-SEM观察细胞丝足并检测SHH定位。
评估MYO10对细胞丝足功能和信号的影响
确定MYO10是否调控细胞丝足形成并在体内影响SHH和WNT信号。
使用Myo10m1J/m1J小鼠，通过SBF-SEM定量细胞丝足长度和密度，通过免疫染色和RNAseq分析信号通路变化。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 免疫染色 | 抗GFP抗体 | Aves | GFP-1020 |
| 抗Pax6抗体 | DSHB | pax6 | |
| 抗Olig2抗体 | Millipore | AB9610 | |
| 抗FOXA2抗体 | Abcam | ab108422 | |
| 抗Nkx2.2抗体 | Novus | NBP1-82554 | |
| 抗SHH抗体（上清） | DSHB | 5E1 | |
| 抗ARL13B抗体 | Proteintech | 17711-1-AP | |
| 抗SHH抗体（H160） | Santa Cruz Biotechnology | sc-9024 | |
| 抗HA抗体（克隆3F10） | Roche | 11867423001 | |
| 抗磷酸化Smad1/5/9抗体（D5B10） | Cell Signaling Technology | 13820 | |
| 抗OLIG3抗体（JE56-40） | Thermo Fisher Scientific | MA5-44904 | |
| 抗V5标签抗体（SV5-Pk1） | Thermo Fisher Scientific | R960-25 | |
| 抗Rab5抗体（E6N8S） | Cell Signaling Technology | 46449 | |
| 抗Rab7抗体（D95F2） | Cell Signaling Technology | 9367 | |
| 抗Rab11抗体（D4F5） | Cell Signaling Technology | 5589 | |
| 抗Rab4抗体 | Thermo Fisher Scientific | PA3-912 | |
| 抗Caveolin-1抗体（D46G3） | Cell Signaling Technology | 3267 | |
| 抗网格蛋白重链抗体（D3C6） | Cell Signaling Technology | 4796 | |
| 抗α-衔接蛋白抗体 | Thermo Fisher Scientific | MA3-061 | |
| 抗SHH抗体（C9C5） | Cell Signaling Technology | 2207 | |
| 抗KIF5B抗体 | Abcam | ab167429 | |
| 抗α-微管蛋白抗体（DM1A） | Cell Signaling Technology | 3873 | |
| 抗β2-衔接蛋白抗体 | Bethyl | A304-718A | |
| DAPI | Thermo Fisher Scientific | D3571 | |
| ActinRed 555 ReadyProbes试剂 | Thermo Fisher Scientific | R37112 | |
| 细胞培养 | 多西环素盐酸盐 | Millipore Sigma | D5207 |
| 细胞表面生物素化 | EZ-Link Sulfo-NHS-生物素 | Thermo Fisher Scientific | 21217 |
| RNAscope | RNAscope探针-Mm-Gli1 | ACD | 311001 |
| 免疫沉淀 | 蛋白A/G PLUS-琼脂糖 | Santa Cruz | sc-2003 |
| 原位杂交 | DIG RNA标记试剂盒（SP6/T7） | Roche | 11175025910 |
| Western blot | ECL Prime Western印迹系统 | Millipore Sigma | GERPN2232 |
| RNAscope | RNAscope多重荧光试剂盒v2 | ACD | 323100 |
| RNA提取 | RNeasy Micro试剂盒 | Qiagen | 74004 |
| RNA测序 | TruSeq RNA文库制备试剂盒v2 | Illumina | RS-122-2001 |
| 荧光素酶报告实验 | 双荧光素酶报告基因检测系统 | Promega | E1960 |
| 细胞培养 | Lipofectamine 3000转染试剂 | Thermo Fisher Scientific | L3000001 |
| Pitstop 2 | Abcam | ab120687 | |
| 免疫沉淀 | EZview红色抗HA亲和凝胶 | Millipore Sigma | E6779 |
| 组织处理 | Tissue-Plus O.C.T.化合物 | Thermo Fisher Scientific | 23730571 |
| UltraPure低熔点琼脂糖 | Thermo Fisher Scientific | 16520050 | |
| 免疫染色 | ProLong Diamond抗淬灭封片剂 | Thermo Fisher Scientific | P36961 |
| ProLong Glass抗淬灭封片剂 | Thermo Fisher Scientific | P36980 | |
| ProLong Gold抗淬灭封片剂（含DAPI） | Thermo Fisher Scientific | P36941 | |
| Fluoromount-G封片剂 | Thermo Fisher Scientific | 00-4958-02 | |
| 正常山羊血清 | Jackson ImmunoResearch Labs | 005-000-121 | |
| 细胞培养 | HBSS，含钙、镁，无酚红 | Thermo Fisher Scientific | 14025076 |
| Dulbecco磷酸盐缓冲液，10X，含钙和镁 | Corning | 20-030-CV | |
| mIMCD3细胞 | ATCC | CRL-2123 | |
| MDCK细胞 | ATCC | CCL-34 | |
| NIH3T3细胞 | ATCC | CRL-1658 | |
| Light II细胞 | ATCC | CVCL_2721 | |
| DispKO小鼠胚胎成纤维细胞 | -- | -- | |
| Myo10敲除小鼠胚胎成纤维细胞 | -- | -- | |
| 动物实验 | C57BL/6J小鼠 | JAX | 000664 |
| B6.129(Cg)-Gt(ROSA)26Sortm4(ACTB-tdTomato,-EGFP)Luo/J (mT/mG)小鼠 | JAX | 007676 | |
| B6.Cg-Shhtm1(EGFP/cre)Cjt/J小鼠 | JAX | 005622 | |
| B6.129X1(Cg)-Shhtm6Amc/J小鼠 | JAX | 008466 | |
| B6.Cg-Myo10m1J/GrsrJ小鼠 | JAX | 024583 | |
| C57BL/6-Disp1INDEL/+小鼠 | -- | -- | |
| C57BL/6-Disp1CS/+小鼠 | -- | -- | |
| 分子克隆 | pcDNA3.1(+) | Thermo Fisher Scientific | V79020 |
| pCDNA3-EGFP | Addgene | 13031 | |
| pCMV-mCherry-Membrane | Addgene | 55779 | |
| pCMV-R-GECO1 | Addgene | 32444 | |
| pCMV-mCherry2 | Addgene | 54517 | |
| pCDNA3.1-mSHH-FL | Stewart et al. | -- | |
| pCDNA3.1-mSHH-FL-EGFP | Hall et al. | -- | |
| pCDNA3.1-V5-DISPWT-HA | Addgene | 126410 | |
| pCDNA3.1-V5-DISPCS-HA | Stewart et al. | -- | |
| pCDNA3.1-V5-DISPΔC-HA | This paper | -- | |
| pCDNA3.1-V5-DISP4xAA-HA | This paper | -- | |
| pCDNA3.1-V5-DISPWT-Dronpa3-HA | This paper | -- | |
| pCDNA3.1-V5-DISPCS-Dronpa3-HA | This paper | -- | |
| pCDNA3.1-DISP ΔC-Dronpa3-HA | This paper | -- | |
| Dronpa3-N1 | Addgene | 54682 | |
| 细胞培养 | pLVX-Tet-On 3G | Takara | 631187 |
| 分子克隆 | pCMV3-hBMP2-GFPSpark | Sino Biological | HG10426-ACG |
| pCMV3-hBMP4-OFPSpark | Sino Biological | HG10609-ACR | |
| pCMV3-hBMP7-GFPSpark | Sino Biological | HG10083-ACG | |
| pCMV3-hWNT1-GFPSpark | Sino Biological | HG10721-ACG | |
| 成像 | TCS SP8 STED 3X共聚焦显微镜 | Leica | -- |
| A1R共聚焦显微镜 | Nikon | -- | |
| Teneo扫描电子显微镜 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| Teneo VolumeScope扫描电子显微镜 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| Bruker Clinscan 7T磁共振成像系统 | Bruker | -- | |
| Siemens Inveon PET/CT系统 | Siemens | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 小鼠模型 | Disp1CS/INDEL和Myo10m1J/m1J小鼠的遗传背景、基因型鉴定方法及胚胎分期 阅读提示：Methods: Disp mice generation, Mice |
| 细胞培养 | 细胞系（IMCD3、MDCK、DispKO MEF等）的来源、培养条件、转染试剂及筛选方法 阅读提示：Methods: Cell lines and culture conditions |
| 体内细胞丝足成像 | 胚胎固定方案、抗体浓度、孵育时间、成像参数（如共聚焦显微镜型号、扫描模式） 阅读提示：Methods: Cytoneme preservation and imaging in mouse embryos |
| 细胞丝足定量分析 | 细胞丝足定义（直径<200nm，长度≥10μm）、计数方法、荧光强度比计算 阅读提示：Methods: Cytoneme preservation and analysis in cell culture |
| 信号活性检测 | SHH Light II报告基因实验中的共培养方式、细胞密度、处理时间；钙通量实验中R-GECO细胞比例、成像时间 阅读提示：Methods: Cytoneme-based SHH signal activation, Luciferase reporter assays |
| 统计学分析 | 统计检验方法、样本量、重复数、显著性阈值 阅读提示：Methods: QUANTIFICATION AND STATISTICAL ANALYSIS |