临床样本表达分析
验证IGFBP5在胶质瘤组织中的表达水平及与临床特征的关系。
利用TCGA、CGGA等数据库进行表达差异分析,并通过组织芯片IHC验证蛋白水平。
IGFBP5, as a Prognostic Indicator Promotes Tumor Progression and Correlates with Immune Microenvironment in Glioma.
包含多数据库生物信息学分析、组织芯片IHC、细胞功能实验(增殖、迁移、侵袭)及Western blot机制验证,但缺乏体内动物模型验证。
胶质瘤组织芯片 U251胶质瘤细胞系 U87胶质瘤细胞系 HEB正常星形胶质细胞
IGFBP5表达与WHO分级、IDH状态、1p/19q共缺失等临床病理特征显著相关 IGFBP5高表达组患者总生存期显著缩短,多因素Cox分析显示IGFBP5为独立预后因素 IGFBP5表达与免疫细胞浸润相关,尤其与巨噬细胞、NK细胞等 IGFBP5敲低显著抑制U251和U87细胞增殖、迁移和侵袭 IGFBP5通过调控EMT和Hippo-YAP通路促进胶质瘤进展,并上调PD-L1和CXCR4表达
提炼研究问题、关键发现与证据,快速把握文章的核心贡献。
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
验证IGFBP5在胶质瘤组织中的表达水平及与临床特征的关系。
利用TCGA、CGGA等数据库进行表达差异分析,并通过组织芯片IHC验证蛋白水平。
评估IGFBP5表达对胶质瘤患者生存预后的预测能力。
使用Kaplan-Meier生存曲线、ROC曲线、单因素和多因素Cox回归及列线图模型分析。
探究IGFBP5表达与肿瘤免疫微环境的关系。
使用CIBERSORT、EPIC、ssGSEA等算法分析免疫细胞浸润,并评估与免疫调节因子的相关性。
验证IGFBP5对胶质瘤细胞增殖、迁移和侵袭的影响。
在U251和U87细胞中敲低或过表达IGFBP5,使用CCK-8、集落形成、划痕和Transwell实验检测。
探究IGFBP5促进胶质瘤进展的分子机制。
使用Western blot检测EMT标志物(E-钙黏蛋白、N-钙黏蛋白、波形蛋白)及Hippo-YAP通路蛋白表达。
按研究目的归类文中使用的方法,便于定位所需技术。
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Hyclone | SH30021.01 |
| 胎牛血清 | Sijiqing | 11011-8611 | |
| 青霉素-链霉素 | -- | -- | |
| 细胞转染 | Lipofectamine 3000转染试剂 | Life Technologies | -- |
| RNA提取 | TRIzol试剂 | Life Technologies | -- |
| 免疫组织化学 | IGFBP5抗体 | Proteintech | 55205-1-AP |
| 免疫反应增强液 | ZSGB-BIO | PV-9000 | |
| HRP标记的山羊抗兔二抗 | -- | -- | |
| AEC显色液 | -- | -- | |
| 细胞增殖实验 | CCK-8试剂盒 | NCM | E606335-0500 |
| Transwell实验 | Transwell小室 | Corning | -- |
| Western blot | RIPA裂解液 | -- | -- |
| PVDF膜 | -- | -- | |
| ECL显影液 | Santa Cruz | -- | |
| GAPDH抗体 | Proteintech | 60004-1-Ig | |
| Vimentin抗体 | Cell Signaling Technology | 5741 | |
| N-cadherin抗体 | Cell Signaling Technology | 13116 | |
| E-cadherin抗体 | Cell Signaling Technology | 4691 | |
| Kibra抗体 | Cell Signaling Technology | 8774 | |
| CXCR4抗体 | Sigma-Aldrich | 4060 | |
| MST1/MST2抗体 | Affinity | DF8569 | |
| p-YAP抗体 | Affinity | AF3328 | |
| YAP1抗体 | Abcam | ab76252 | |
| p-MST1/MST2抗体 | Invitrogen | PA5-40255 | |
| PD-L1抗体 | Proteintech | 28076-1-AP | |
| 质粒构建 | pCMV3-IGFBP5-GFP质粒 | Sino Biological | HG10206-ACG |
| pCMV3-C-GFP载体 | Sino Biological | CV026 |
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养 | 细胞系来源:U251和U87来自中国典型培养物保藏中心(CTCC);培养基:DMEM(Hyclone)添加10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素;培养条件:37°C、5% CO2 阅读提示:详见Materials and methods中的Cell culture and tissue samples部分 |
| 细胞转染 | 转染试剂:Lipofectamine 3000;siRNA序列:见补充表2;质粒:pCMV3-IGFBP5-GFP(Sino Biological) 阅读提示:详见Materials and methods中的Transduction, RNA extraction and qRT-PCR部分 |
| 增殖实验 | CCK-8检测:细胞密度2×10^3/孔,于24h、48h、72h加入CCK-8试剂孵育2h,测量450nm吸光度;实验独立重复三次 阅读提示:详见Materials and methods中的Cell proliferation and colony formation assay部分 |
| 迁移和侵袭实验 | Transwell小室孔径8μm;迁移实验未预包被,侵袭实验预包被基质胶;细胞密度5×10^4/孔;孵育24h; 阅读提示:详见Materials and methods中的Transwell migraion and invasion assays部分 |
| Western blot | 抗体稀释比例:IGFBP5 1:500, PD-L1 1:1000, GAPDH 1:2000, 其他抗体1:1000;用于验证蛋白表达 阅读提示:详见Materials and methods中的Western blot assay部分 |