IGFBP5作为预后指标促进胶质瘤进展并与免疫微环境相关

IGFBP5, as a Prognostic Indicator Promotes Tumor Progression and Correlates with Immune Microenvironment in Glioma.

作者信息Jiediao Lin, Guowei Huang, Qianru Zeng, Rendong Zhang, Yun Lin, Yaochen Li, Baohua Huang, Hongchao Pan
PMID38164271
期刊J Cancer
发布时间2024-01-01
DOI10.7150/jca.87733

实验完整度

包含多数据库生物信息学分析、组织芯片IHC、细胞功能实验(增殖、迁移、侵袭)及Western blot机制验证,但缺乏体内动物模型验证。

主要模型

胶质瘤组织芯片 U251胶质瘤细胞系 U87胶质瘤细胞系 HEB正常星形胶质细胞

重点核对

IGFBP5表达与WHO分级、IDH状态、1p/19q共缺失等临床病理特征显著相关 IGFBP5高表达组患者总生存期显著缩短,多因素Cox分析显示IGFBP5为独立预后因素 IGFBP5表达与免疫细胞浸润相关,尤其与巨噬细胞、NK细胞等 IGFBP5敲低显著抑制U251和U87细胞增殖、迁移和侵袭 IGFBP5通过调控EMT和Hippo-YAP通路促进胶质瘤进展,并上调PD-L1和CXCR4表达

摘要

背景:胰岛素样生长因子结合蛋白5(IGFBP5)在包括胶质瘤在内的多种人类癌症中高表达。尽管如此,其在胶质瘤中的作用仍不清楚。本研究旨在分析IGFBP5是否可作为胶质瘤预后和免疫浸润的预测因子。方法:从癌症基因组图谱(TCGA)、中国胶质瘤基因组图谱(CGGA)、Rembrandt和Gravendeel数据库中收集胶质瘤患者的临床信息。通过Kaplan-Meier生存曲线、诊断性受试者工作特征(ROC)曲线、列线图模型、Cox回归分析和R软件富集分析评估IGFBP5的诊断和预后作用。此外,还进行了IGFBP5表达与免疫细胞浸润及免疫检查点基因之间的相关性分析。采用免疫组织化学染色、CCK8、集落形成、划痕和Transwell实验以及Western blot检测IGFBP5在胶质瘤中的表达和功能。结果:IGFBP5水平在恶性程度较高的胶质瘤中明显升高,并通过单因素和多因素Cox分析预测不良预后。生物学功能分析显示,IGFBP5与免疫特征密切相关。此外,IGFBP5表达与B细胞、T细胞、巨噬细胞和NK细胞的肿瘤浸润相关。IGFBP5影响胶质瘤细胞的增殖、迁移和侵袭,可能涉及上皮间质转化(EMT)和Hippo-YAP信号通路。进一步研究表明,IGFBP5诱导PD-L1和CXCR4的表达。结论:IGFBP5作为癌基因是胶质瘤预后的有用生物标志物,并与胶质瘤的进展和免疫浸润相关。

实验结论

提炼研究问题、关键发现与证据,快速把握文章的核心贡献。

研究问题
IGFBP5在胶质瘤中的表达、预后价值及其对免疫微环境的影响。
核心机制
IGFBP5可能通过调节EMT和Hippo-YAP信号通路促进胶质瘤细胞增殖、迁移和侵袭,并上调PD-L1和CXCR4表达,从而影响免疫微环境。
主要证据
基于TCGA、CGGA等多数据库分析显示IGFBP5高表达与不良预后相关;体外实验证实敲低IGFBP5抑制细胞增殖、迁移和侵袭,过表达则促进;Western blot显示IGFBP5调控EMT和Hippo-YAP通路蛋白表达。
研究意义
IGFBP5可作为胶质瘤的预后生物标志物和潜在的免疫治疗靶点。

研究路径

按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。

1

临床样本表达分析

验证IGFBP5在胶质瘤组织中的表达水平及与临床特征的关系。

利用TCGA、CGGA等数据库进行表达差异分析,并通过组织芯片IHC验证蛋白水平。

2

预后价值评估

评估IGFBP5表达对胶质瘤患者生存预后的预测能力。

使用Kaplan-Meier生存曲线、ROC曲线、单因素和多因素Cox回归及列线图模型分析。

3

免疫浸润相关性分析

探究IGFBP5表达与肿瘤免疫微环境的关系。

使用CIBERSORT、EPIC、ssGSEA等算法分析免疫细胞浸润,并评估与免疫调节因子的相关性。

4

细胞功能实验

验证IGFBP5对胶质瘤细胞增殖、迁移和侵袭的影响。

在U251和U87细胞中敲低或过表达IGFBP5,使用CCK-8、集落形成、划痕和Transwell实验检测。

5

机制通路验证

探究IGFBP5促进胶质瘤进展的分子机制。

使用Western blot检测EMT标志物(E-钙黏蛋白、N-钙黏蛋白、波形蛋白)及Hippo-YAP通路蛋白表达。

研究方法

按研究目的归类文中使用的方法,便于定位所需技术。

产品清单

实验环节名称品牌货号
DMEM培养基HycloneSH30021.01
胎牛血清Sijiqing11011-8611
青霉素-链霉素----
Lipofectamine 3000转染试剂Life Technologies--
TRIzol试剂Life Technologies--
IGFBP5抗体Proteintech55205-1-AP
免疫反应增强液ZSGB-BIOPV-9000
HRP标记的山羊抗兔二抗----
AEC显色液----
CCK-8试剂盒NCME606335-0500
Transwell小室Corning--
RIPA裂解液----
PVDF膜----
ECL显影液Santa Cruz--
GAPDH抗体Proteintech60004-1-Ig
Vimentin抗体Cell Signaling Technology5741
N-cadherin抗体Cell Signaling Technology13116
E-cadherin抗体Cell Signaling Technology4691
Kibra抗体Cell Signaling Technology8774
CXCR4抗体Sigma-Aldrich4060
MST1/MST2抗体AffinityDF8569
p-YAP抗体AffinityAF3328
YAP1抗体Abcamab76252
p-MST1/MST2抗体InvitrogenPA5-40255
PD-L1抗体Proteintech28076-1-AP
pCMV3-IGFBP5-GFP质粒Sino BiologicalHG10206-ACG
pCMV3-C-GFP载体Sino BiologicalCV026

关键环节

汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。

环节核对要点
细胞培养
细胞系来源:U251和U87来自中国典型培养物保藏中心(CTCC);培养基:DMEM(Hyclone)添加10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素;培养条件:37°C、5% CO2
阅读提示:详见Materials and methods中的Cell culture and tissue samples部分
细胞转染
转染试剂:Lipofectamine 3000;siRNA序列:见补充表2;质粒:pCMV3-IGFBP5-GFP(Sino Biological)
阅读提示:详见Materials and methods中的Transduction, RNA extraction and qRT-PCR部分
增殖实验
CCK-8检测:细胞密度2×10^3/孔,于24h、48h、72h加入CCK-8试剂孵育2h,测量450nm吸光度;实验独立重复三次
阅读提示:详见Materials and methods中的Cell proliferation and colony formation assay部分
迁移和侵袭实验
Transwell小室孔径8μm;迁移实验未预包被,侵袭实验预包被基质胶;细胞密度5×10^4/孔;孵育24h;
阅读提示:详见Materials and methods中的Transwell migraion and invasion assays部分
Western blot
抗体稀释比例:IGFBP5 1:500, PD-L1 1:1000, GAPDH 1:2000, 其他抗体1:1000;用于验证蛋白表达
阅读提示:详见Materials and methods中的Western blot assay部分