全激酶组siRNA筛选
鉴定ccRCC中TBK1的上游激酶调控因子
使用Silencer Select人激酶siRNA文库转染UMRC6细胞，通过Western blot检测pTBK1/TBK1比值，筛选出候选基因。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
全激酶组siRNA筛选鉴定出透明细胞肾细胞癌中的DCLK2-TBK1致癌信号轴
Kinome-wide siRNA screen identifies a DCLK2-TBK1 oncogenic signaling axis in clear cell renal cell carcinoma.
实验完整度
高包含siRNA筛选、体外激酶实验、质谱分析、细胞功能实验、原位及皮下异种移植模型、患者样本分析等多层级验证，并明确机制验证。
主要模型
UMRC6细胞系 A498细胞系 769-P细胞系 NSG小鼠原位肾肿瘤模型
重点核对
siRNA筛选使用UMRC6细胞，转染10pmol siRNA，60小时后检测pTBK1 体外激酶实验使用重组DCLK2和体外翻译的TBK1，30°C孵育1小时 DCLK2敲低和敲除实验在UMRC6、769-P和A498细胞中进行，验证软琼脂集落形成 体内实验使用A498-Luciferase细胞原位注射到NSG小鼠肾包膜，每只注射5x10^5细胞 过表达实验使用强力霉素诱导的pInducer载体，并验证DCLK2203对pTBK1和肿瘤生长的影响
摘要
TANK结合激酶1（TBK1）是包括透明细胞肾细胞癌（ccRCC）在内的多种癌症的潜在治疗靶点。然而，在临床实践中靶向TBK1具有挑战性。克服这一挑战的一种方法是鉴定一个可以在癌症中特异性靶向治疗的TBK1上游调控因子。在本研究中，我们进行了全激酶组siRNA筛选，并鉴定出双皮质素样激酶2（DCLK2）作为ccRCC中的TBK1调控因子。DCLK2结合并直接磷酸化TBK1的Ser172。DCLK2的耗竭抑制了原位异种移植模型中的锚定非依赖性集落生长和肾肿瘤发生。相反，过表达DCLK2203（一种在ccRCC中占主导地位的短亚型）可促进ccRCC细胞生长和体内肿瘤发生。机制上，DCLK2203通过TBK1磷酸化和激活来发挥其致癌信号传导。综上所述，这些结果表明DCLK2是TBK1激活剂，也是ccRCC的潜在治疗靶点。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- TBK1在ccRCC中如何被上游激酶激活，以及该激酶是否可作为治疗靶点？
- 核心机制
- DCLK2（特别是DCLK2203亚型）直接结合并磷酸化TBK1的Ser172，激活TBK1，进而磷酸化p62 Ser366，促进ccRCC肿瘤发生。
- 主要证据
- siRNA筛选发现DCLK2，体外激酶实验和质谱确认Ser172磷酸化；DCLK2敲低/敲除降低pTBK1并抑制体外集落形成和体内肿瘤生长；DCLK2203过表达促进肿瘤生长，且依赖其激酶活性。
- 研究意义
- DCLK2作为TBK1上游激活剂，为ccRCC治疗提供了潜在的新策略，尤其是通过靶向DCLK2选择性抑制TBK1活性。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
候选基因验证
验证候选基因对TBK1磷酸化的影响及其与TBK1的结合和直接磷酸化能力
在UMRC6细胞中分别转染针对候选基因的3条siRNA和混合siRNA，检测pTBK1水平；通过共转染和免疫共沉淀检测蛋白结合；通过体外激酶实验检测直接磷酸化。
DCLK2功能缺失实验
评估DCLK2对TBK1磷酸化和ccRCC细胞生长的影响
使用siRNA和CRISPR-Cas9敲低/敲除DCLK2，检测pTBK1和p62磷酸化，并进行软琼脂集落形成实验。
体内肿瘤模型验证
验证DCLK2缺失对体内肾肿瘤生长的影响
将表达sgCtrl或sgDCLK2的A498-Luciferase细胞原位注射到NSG小鼠肾包膜，通过生物发光成像监测肿瘤生长，并分析肿瘤重量和pTBK1水平。
DCLK2亚型功能研究
确定DCLK2201和DCLK2203亚型对TBK1磷酸化和ccRCC生长的不同作用
设计特异性siRNA和shRNA分别敲低DCLK2201和DCLK2203，检测pTBK1和软琼脂集落；过表达各亚型检测对生长的影响。
机制研究
验证DCLK2203通过TBK1磷酸化促进肿瘤发生的机制
使用DCLK2203激酶死突变体（K423A）检测其对TBK1磷酸化和功能的影响；通过TBK1敲低验证DCLK2203的作用依赖TBK1；比较DCLK1和DCLK2201的T693A突变。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| siRNA筛选 | Silencer™ Select人激酶siRNA文库V4 | Thermo Fisher Scientific | Cat# 4397918 |
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Gibco | -- |
| RPMI-1640培养基 | Gibco | -- | |
| 胎牛血清 | Gibco | -- | |
| 青霉素/链霉素 | Gibco | -- | |
| 支原体检测试剂盒 | Lonza | LT07–218 | |
| 转染 | Lipofectamine RNAi Max转染试剂 | Invitrogen | Cat# 13778150 |
| Lipofectamine 3000转染试剂 | Thermo Fisher Scientific | Cat# L3000015 | |
| 免疫沉淀 | 抗FLAG M2亲和凝胶 | Millipore-Sigma | Cat# A2220 |
| Western blot | 兔抗TBK1抗体 | Cell Signaling Technology | Cat# 3504; RRID: AB_2255663 |
| 兔抗磷酸化TBK1(Ser172)抗体 | Cell Signaling Technology | Cat# 5483; RRID:AB_10693472 | |
| 兔抗DCLK2抗体 | Thermo Fisher Scientific | Cat# PA5-106515; RRID:AB_2854184 | |
| 体外激酶实验 | 重组人DCLK2蛋白 | SignalChem | Cat# D15-11G-10 |
| T7快速偶联转录/翻译系统 | Promega | L1170 | |
| RNA提取 | RNeasy小型试剂盒 | Qiagen | Cat# 74106 |
| cDNA合成 | iScript™ cDNA合成试剂盒 | Bio-Rad | Cat# 1708891 |
| 软琼脂实验 | 琼脂糖 | Fisher Scientific | Cat# BP165-25 |
| 碘硝基四氮唑氯 | Sigma-Aldrich | Cat# I8377 | |
| 动物实验 | 基质胶 | Corning | Cat# 354234 |
| Purina啮齿动物饲料含多西环素 | Research Diets | Cat# C11300-2000i | |
| 质粒构建 | KOD-Plus定点突变试剂盒 | Toyobo | Cat# SMK-101 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| siRNA筛选 | 细胞系：UMRC6；siRNA浓度：10pmol/孔；转染试剂：Lipofectamine RNAi Max；检测时间：转染后60小时 阅读提示：STAR Methods - Kinome-wide siRNA screen |
| 体外激酶实验 | TBK1为体外翻译产物；激酶为重组人DCLK2；反应体系含1μL 10mmol/L ATP；反应条件：30°C，600rpm，1小时 阅读提示：STAR Methods - In vitro kinase assay |
| 细胞培养 | 细胞系：UMRC6、A498、769-P等；培养基：DMEM或RPMI-1640含10% FBS和1%青霉素/链霉素；培养条件：37°C，5% CO2；细胞传代数：10-20代 阅读提示：STAR Methods - Cell lines |
| 原位肿瘤模型 | 动物：NSG小鼠，8周龄；细胞：A498-Luciferase稳定表达sgCtrl/sgDCLK2或shCtrl/shDCLK2亚型；细胞数：5x10^5；注射体积：20μL PBS含50%基质胶；注射部位：左肾包膜；监测：每周生物发光成像 阅读提示：STAR Methods - Orthotopic kidney tumor xenograft |
| 皮下肿瘤模型 | 动物：NSG小鼠，6周龄，雄性；细胞：A498细胞1.5x10^6；注射体积：100μL PBS含50%基质胶；注射部位：左胁腹；肿瘤大小测量：每周用卡尺；体积计算公式：V = 0.5 x L x S^2 阅读提示：STAR Methods - Subcutaneous tumor xenograft |