疫苗设计与构建
验证AdC68-HATRBD能否表达设计的双抗原（RBD二聚体和HA）
基于AdC68载体，插入两个嵌合RBD二聚体（baRBD和odRBD）、保守T细胞表位和pH1N1全长HA，包装并纯化重组腺病毒。
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鼻内联合疫苗诱导针对COVID-19和流感的全身及黏膜免疫
An intranasal combination vaccine induces systemic and mucosal immunity against COVID-19 and influenza.
实验完整度
高包含体外表达验证、小鼠免疫原性研究、SARS-CoV-2和流感病毒攻毒保护实验，以及异源加强策略评估，涵盖体液和细胞免疫检测。
主要模型
C57BL/6J小鼠 K18-hACE2转基因小鼠 HEK293细胞
重点核对
疫苗剂量：5×10^7 IFU AdC68-HATRBD（鼻内给药） 免疫程序：初免-加强（prime-boost）与单独初免比较 攻毒株：SARS-CoV-2 BA.5.2（1×10^5 FFU）和pH1N1（10×LD50） 评价终点：血清中和抗体、黏膜IgA、T细胞应答、病毒载量和病理评分 对照：PBS对照组
摘要
尽管进行了持续的监测和干预，严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）和流感病毒仍然对全球健康构成严重负担。因此，我们开发了一种基于黑猩猩腺病毒的联合疫苗AdC68-HATRBD，具有针对SARS-CoV-2和流感病毒的双重特异性。当作为独立疫苗使用时，鼻内免疫AdC68-HATRBD诱导了全面而强效的免疫应答，包括免疫球蛋白（Ig）G、黏膜IgA、中和抗体和记忆T细胞，从而保护小鼠免受BA.5.2和大流行H1N1感染。当作为异源加强免疫时，AdC68-HATRBD显著改善了已获许可的SARS-CoV-2或流感疫苗的保护性免疫应答。因此，无论是作为独立疫苗还是加强疫苗鼻内给药，该联合疫苗均是通过诱导强效的全身和黏膜免疫应答来增强整体疫苗效力的有价值策略，从而为这两种病毒提供双重免疫防线。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 开发一种针对SARS-CoV-2和流感病毒的联合疫苗，并评估其作为独立疫苗和异源加强剂时的免疫原性和保护效力。
- 核心机制
- 疫苗通过诱导全身和黏膜免疫应答，包括IgG、IgA、中和抗体和Th1偏向的T细胞应答，提供针对两种病毒的保护。
- 主要证据
- 在小鼠模型中，鼻内免疫AdC68-HATRBD诱导了针对SARS-CoV-2和流感病毒的中和抗体和T细胞应答，并保护小鼠免受BA.5.2和致死性pH1N1攻击；作为异源加强剂时，增强了已许可疫苗的抗体和细胞免疫反应。
- 研究意义
- 该联合疫苗可作为经济有效的策略，通过诱导全身和黏膜免疫来增强整体疫苗效力，并可能减少疫苗接种次数，提高接种覆盖率。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
体外表达验证
验证疫苗载体在体外的抗原表达
用不同剂量AdC68-HATRBD转导HEK293细胞，通过Western blot检测RBD二聚体和HA表达。
小鼠免疫原性评估
评估AdC68-HATRBD鼻内免疫诱导的体液和细胞免疫应答
C57BL/6J小鼠通过鼻内途径以初免或初免-加强方案免疫，检测血清和BALF中的结合抗体、中和抗体及T细胞应答。
SARS-CoV-2攻毒保护实验
评估疫苗对SARS-CoV-2变异株BA.5.2的保护效果
K18-hACE2转基因小鼠免疫后，用BA.5.2攻毒，监测体重、生存率、病毒载量和肺部病理。
流感病毒攻毒保护实验
评估疫苗对致死性pH1N1攻击的保护效果
C57BL/6J小鼠免疫后，用10×LD50的pH1N1攻毒，监测体重、生存率、病毒载量和肺部病理。
异源加强免疫实验
评估AdC68-HATRBD作为已许可疫苗加强剂的效果
先用ZF2001或QIV免疫小鼠，再用AdC68-HATRBD鼻内加强，检测抗体和T细胞应答。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 疫苗构建与包装 | QuickTiter™ 腺病毒滴度免疫检测试剂盒 | Cell Biolabs | -- |
| Western blot | 抗SARS-CoV-2 RBD抗体 | Sino Biological | 40592-T62 |
| 抗甲型流感HA抗体 | Sino Biological | 86001-RM01 | |
| 辣根过氧化物酶标记的抗兔IgG抗体 | Abcam | ab6721 | |
| β-肌动蛋白抗体 | Proteintech | HRP-60008 | |
| ELISA | RBD蛋白 | Sino Biological | -- |
| HA蛋白 | Sino Biological | -- | |
| 辣根过氧化物酶标记的抗小鼠IgG抗体 | Abcam | ab6789 | |
| 辣根过氧化物酶标记的抗小鼠IgA | Southern Biotech | 1040-05 | |
| TMB底物 | NCM Biotech | -- | |
| 酶标仪 | Tecan | -- | |
| 假病毒中和试验 | 聚乙烯亚胺 | Polysciences | -- |
| 聚乙二醇8000 | -- | -- | |
| 慢病毒定量试剂盒 | Beijing Biodragon Immunotechnologies Co., Ltd | -- | |
| SteadyGlo荧光素酶检测系统 | Promega | -- | |
| 活病毒中和试验 | 兔抗N蛋白抗体 | Abclonal | A18797 |
| 过氧化物酶标记的抗兔IgG | Abclonal | AS014 | |
| 过氧化物酶底物 | Seracare | -- | |
| ImmunoSpot显微分析仪 | CTL | -- | |
| 血凝抑制试验 | 受体破坏酶 | Denka Seiken | -- |
| 流式细胞术 | GolgiPlug | BD Biosciences | -- |
| Fc受体阻断剂 | BD Biosciences | 14-0161-85 | |
| LIVE/DEAD可固定染料 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| PerCP/Cyanine5.5-CD3ε抗体 | BioLegend | 100328 | |
| APC-Cy7-CD4抗体 | Thermo Fisher Scientific | A15384 | |
| Alexa Fluor 700-CD8a抗体 | BioLegend | 100730 | |
| FITC-CD44抗体 | Thermo Fisher Scientific | 48-0621-80 | |
| 固定/透化液 | BD Biosciences | -- | |
| APC-IFN-γ抗体 | BioLegend | 505810 | |
| Brilliant Violet 421-TNF-α抗体 | BioLegend | 506328 | |
| PE-IL-13抗体 | BioLegend | 159403 | |
| PE-Cy7-IL-4抗体 | BioLegend | 504118 | |
| BD LSRFortessa流式细胞仪 | BD Bioscience | -- | |
| ELISpot | 小鼠IFN-γ ELISpot基础试剂盒 | MabTech | -- |
| 小鼠IL-4 ELISpot基础试剂盒 | MabTech | -- | |
| Multiscreen IP ELISpot板 | Millipore | -- | |
| 病毒载量检测 | TIANamp基因组DNA提取试剂盒 | Tiangen | -- |
| Roche LightCycler® 480系统 | Roche | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 疫苗构建与体外表达 | AdC68载体E1/E3缺失及E4替换细节，抗原基因序列及插入位点 阅读提示：Methods（Vaccine construction） |
| 免疫程序 | 小鼠品系、性别、年龄、免疫剂量（5×10^7 IFU）、给药途径（鼻内）、体积（15 μl）、对照组（PBS）、时间点 阅读提示：Methods（Immunization and challenge） |
| 攻毒实验（SARS-CoV-2） | 攻毒株BA.5.2，剂量1×10^5 FFU，攻毒时间（免疫后8周），观察终点（5天），病毒载量检测（gRNA/sgRNA）及病理评分标准 阅读提示：Methods（Immunization and challenge），Figure 4 legend |
| 攻毒实验（流感） | 攻毒株pH1N1，剂量10×LD50，攻毒时间（免疫后8周），观察期（15天），病毒载量检测和病理评分 阅读提示：Methods（Immunization and challenge），Figure 5 legend |
| 异源加强实验 | 初免疫苗剂量（ZF2001：5μg，QIV：3μg）、给药途径（肌内）、加强剂量（5×10^7 IFU）、间隔时间（4周）、检测时间点 阅读提示：Figure 6和7的图例，Methods（Immunization and challenge） |