S和N DNA疫苗的构建与表达验证
构建表达野生型SARS-CoV-2 S和N蛋白的DNA疫苗，并验证其在体外细胞中的抗原表达。
将密码子优化的S和N基因克隆至pVAX1载体，转染细胞后通过免疫印迹等方法确认蛋白表达。
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基于刺突蛋白和核衣壳蛋白的DNA疫苗联合免疫对SARS-CoV-2 Omicron的长期保护性免疫
Co-immunization with spike and nucleocapsid based DNA vaccines for long-term protective immunity against SARS-CoV-2 Omicron.
实验完整度
高包含体外免疫原性分析、体内短期和长期攻毒保护实验、组织病理学、T细胞耗竭实验等多个独立证据层级，且包含功能验证和机制验证。
主要模型
K18-hACE2转基因小鼠 SARS-CoV-2 Beta变异株攻毒模型 SARS-CoV-2 Omicron BA.2变异株攻毒模型
重点核对
K18-hACE2转基因小鼠（表达人ACE2） DNA疫苗剂量：25 µg，肌肉注射，第0天初免，第21天加强 攻毒剂量：Beta 10^3 PFU，Omicron BA.2 10^4 PFU，鼻内接种 T细胞耗竭：抗CD4和抗CD8单克隆抗体，250 µg，腹腔注射，攻毒前连续3天 检测时间点：短期攻毒在加强后14天，长期攻毒在加强后119天（第140天）
摘要
SARS-CoV-2变种的持续进化对现有基于刺突蛋白（S）的COVID-19疫苗的持久性构成挑战。我们假设，与仅基于S蛋白的疫苗相比，包含S和核衣壳蛋白（N）抗原的疫苗可通过增强和扩大细胞免疫来提高保护的持久性。为了验证这一点，我们检测了野生型SARS-CoV-2 S和N DNA疫苗单独或联合接种K18-hACE2小鼠的免疫原性和效力。S、N和S+N疫苗均能引发多功能的CD4+和CD8+ T细胞反应，并对Beta和Omicron BA.2变种提供短期交叉保护，但只有S+N疫苗联合免疫能提供针对Omicron BA.2的长期保护。清除CD4+和CD8+ T细胞降低了长期效力，表明T细胞在保护持久性中发挥关键作用。这些发现强调了在下一代COVID-19疫苗中结合S和N抗原以增强针对SARS-CoV-2变种的长期保护性免疫的潜力。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 与仅基于S蛋白的疫苗相比，结合S和N抗原的DNA疫苗是否能增强对SARS-CoV-2变种的保护持久性和广度？
- 核心机制
- S+N疫苗诱导的T细胞免疫（特别是CD4+和CD8+ T细胞）在长期交叉保护中发挥关键作用，而针对Omicron BA.2的中和抗体几乎检测不到。
- 主要证据
- 在K18-hACE2小鼠中，S+N疫苗在短期（35天）和长期（140天）攻毒实验中均能保护肺部免受Omicron BA.2感染，且T细胞耗竭后保护作用丧失。
- 研究意义
- 该研究提供了概念验证，表明同时免疫N和S抗原可增强COVID-19疫苗的持久性和广度，为下一代疫苗设计提供策略。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
小鼠免疫与体液免疫评估
评估S、N和S+N DNA疫苗在小鼠中诱导的抗体反应及中和活性。
K18-hACE2小鼠在第0天和第21天肌肉注射疫苗，收集血清，通过ELISA检测N、S和RBD特异性IgG滴度，通过pVNT检测中和抗体。
T细胞反应评估
评估疫苗诱导的抗原特异性CD4+和CD8+ T细胞的表型和功能。
免疫后第28天取脾脏和肺，分离白细胞，用S和N肽段刺激，通过ICS染色检测多功能和细胞毒性T细胞。
短期攻毒保护实验
评估疫苗对SARS-CoV-2 Beta和Omicron BA.2变种的短期保护效力。
免疫后第35天（加强后14天），小鼠经鼻内接种Beta或Omicron BA.2，3天后检测呼吸道组织和脑中的病毒RNA，并评估肺部病理和T细胞反应。
长期攻毒保护实验
评估疫苗对Omicron BA.2变种的长期保护是否优于短期，并探讨T细胞的作用。
免疫后第140天（加强后119天）攻毒Omicron BA.2，3天后检测病毒RNA、肺病理和T细胞反应，并进行T细胞耗竭实验。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证细胞功能变化
验证免疫效应
评估体内效果
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 疫苗构建 | pVAX1质粒载体 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| 免疫 | Tris-EDTA缓冲液（pH 8.0） | Invitrogen | 15568025 |
| BD-25150胰岛素注射器 | BD Bioscience | BD-25150 | |
| BTX AgilePulse肌肉注射系统 | -- | 47-0500N | |
| ELISA | 辣根过氧化物酶标记的抗小鼠IgG | Jackson ImmunoResearch | 115-035-008 |
| 一步法TMB底物 | Thermo Fisher Scientific | 34028 | |
| SpectraMax M2酶标仪 | Molecular Devices | -- | |
| pVNT | Vero细胞 | ATCC | CCL81 |
| Hoechst染料 | Thermo Fisher Scientific | 62249 | |
| Cell Insight CX5成像仪 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| ICS | 布雷菲德菌素A | BioLegend | 420601 |
| 抗CD107a PE抗体 | eBioscience | 12-1071-83 | |
| PMA和离子霉素 | eBioscience | 00-4970-93 | |
| 活细胞染料efluor 455 UV | eBioscience | 65-0868-18 | |
| Fc受体阻断剂（CD16/CD32单抗2.4G2） | BD Biosciences | 553142 | |
| 抗CD3e PE-Cy7抗体 | eBioscience | 25-0031-82 | |
| 抗CD4 BUV395抗体 | BD Bioscience | 565974 | |
| 抗CD8a BV510抗体 | BioLegend | 100751 | |
| 抗CD44 BV785抗体 | BioLegend | 103041 | |
| 抗CD62-L APC efluor 780抗体 | eBioscience | 47-0621-82 | |
| Cytofix/Cytoperm固定破膜试剂盒 | BD Bioscience | 554722 | |
| 抗IFN-γ FITC抗体 | Tonbo Bioscience | 35-7311-U100 | |
| 抗TNF-α APC抗体 | eBioscience | 17-7321-82 | |
| 抗IL-2 BV711抗体 | BioLegend | 503837 | |
| LSRFortessa流式细胞仪 | BD Bioscience | -- | |
| 病毒扩增 | Vero E6细胞 | ATCC | CRL-1587 |
| DMEM培养基 | Corning | 10-013-CV | |
| 青霉素-链霉素 | Gibco | 15140-122 | |
| HEPES缓冲液 | Gibco | 15630130 | |
| 非必需氨基酸 | Gibco | 11140050 | |
| 羧甲基纤维素 | -- | -- | |
| 结晶紫 | -- | -- | |
| 组织采集 | RNA/DNA保护液 | ZYMO Research | R1100-250 |
| T细胞耗竭 | 抗CD4单克隆抗体（克隆GK1.5） | Bio X Cell | BE0003-1 |
| 抗CD8单克隆抗体（克隆2.43） | Bio X Cell | BE0061 | |
| 组织病理学 | Leica ST5020自动染色机 | Leica | -- |
| Zeiss AxioScan Z1扫描仪 | Zeiss | -- | |
| qRT-PCR | RNeasy RNA提取试剂盒 | Qiagen | 52904 |
| qScript一步法qRT-PCR试剂盒 | Quanta BioSciences | 76047-080 | |
| CFX实时PCR系统 | Bio-Rad | -- | |
| SARS-CoV-2 RNA标准品 | ATCC | NR-52347 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 小鼠模型 | K18-hACE2转基因小鼠来源、性别和年龄 阅读提示：Methods: Mice |
| 疫苗构建 | S和N基因序列、质粒载体、启动子、增强序列 阅读提示：Methods: S and N DNA vaccines |
| 免疫方案 | 疫苗剂量（25 µg）、注射途径（肌肉）、注射位点（单独免疫同侧，联合免疫对侧）、电穿孔参数 阅读提示：Methods: Immunization and tissue collection for immunogenicity experiments |
| 攻毒实验 | 攻毒病毒株（Beta、Omicron BA.2）、攻毒剂量（Beta 10^3 PFU，Omicron BA.2 10^4 PFU）、攻毒途径（鼻内）、攻毒时间（短期第35天，长期第140天） 阅读提示：Methods: Viruses and in vivo challenge |
| T细胞耗竭 | 抗CD4和抗CD8抗体克隆、剂量（250 µg）、给药途径（腹腔）、给药时间（攻毒前第137-139天） 阅读提示：Methods: In vivo T cell depletion and viral challenge |