重组RBD和RBD-P蛋白的生成与生产
在大肠杆菌中表达和纯化RBD和RBD-P蛋白，用于后续表征和免疫评估。
设计了40AV肽融合RBD（RBD-P）和无肽RBD，基因合成后克隆至pET15b，转化E. coli BL21(DE3)。在摇瓶和生物反应器中培养，IPTG诱导表达，通过包涵体分离、溶解和色谱纯化获得蛋白。
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口服重组修饰的SARS-CoV-2 RBD抗原作为COVID-19护理的可能免疫刺激剂
Oral administration of a recombinant modified RBD antigen of SARS-CoV-2 as a possible immunostimulant for the care of COVID-19.
实验完整度
中包含体外抗原表征（SDS-PAGE、CD、质谱）和体内小鼠免疫实验，但缺乏攻毒保护实验、IgA检测和细胞免疫评估。
主要模型
BALB/c小鼠 大肠杆菌BL21(DE3)表达系统
重点核对
RBD抗原浓度：0.1 mg/mL 口服免疫剂量：10 μg/只（0.4 μg/g） 免疫方案：两次口服免疫，间隔15天 血清采集时间：首次免疫前和第45天 检测方法：ELISA和中和试验
摘要
背景
开发针对SARS-CoV-2的有效疫苗，考虑生产限制、公平获取和接受度，对于开发能够有效呈递抗原以产生中和抗体的平台以及作为新疫苗的模型是必要的。
结果
本研究通过口服给药与肽融合的SARS-CoV-2 RBD抗原，提出了一种适用技术的开发，以改善其抗原呈递。我们专注于开发和生产在大肠杆菌中生产的重组受体结合域（RBD），并添加氨基酸延伸以改善抗原呈递。生产在摇瓶和生物反应器培养中进行，获得约200 mg/L的抗原。使用SDS-PAGE凝胶、高效液相色谱和圆二色光谱对肽融合RBD和无肽RBD蛋白进行了表征和比较。将肽融合RBD配制成水包油乳液，用于小鼠口服免疫。与RBD相比，肽融合RBD在小鼠中诱导了强健的IgG产生，能够通过酶联免疫吸附试验识别重组RBD。此外，肽融合RBD在给药小鼠的血清中产生了中和抗体。该制剂未观察到反应性发作，也未出现温度或呕吐变化。
结论
我们的研究证明了所设计的肽添加到RBD中通过口服给药改善抗原免疫刺激的有效性。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 评估将40AV肽融合到SARS-CoV-2 RBD抗原上，通过口服给药是否能增强抗原呈递并诱导中和抗体的产生。
- 核心机制
- 40AV肽可能通过促进RBD在脂质环境（如水包油乳液）中的招募，增强抗原呈递，从而改善口服免疫原性。
- 主要证据
- 在小鼠中口服免疫RBD-P后，ELISA检测到显著的IgG反应，中和试验显示抑制RBD与hACE2结合，而RBD组无显著反应。
- 研究意义
- 本研究为开发口服SARS-CoV-2疫苗候选提供了基础，该候选疫苗可诱导免疫反应，并强调了可扩展的生产生物过程和融合肽在简单乳液制剂中改善RBD免疫原性的作用。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
RBD和RBD-P的体外表征
验证重组蛋白的纯度、结构完整性和抗原性。
通过SDS-PAGE、Western blot、质谱分析确认分子量。圆二色光谱分析二级结构，ELISA检测COVID-19患者血清的识别。
油包水乳液制备与体内免疫
评估口服RBD-P抗原的免疫原性和安全性。
将纯化的RBD或RBD-P蛋白配制成水包油乳液，口服免疫BALB/c小鼠两次（间隔15天），同时设立对照组和肌内免疫组。
抗体反应和中和活性检测
评估免疫血清中针对RBD的IgG水平及其中和病毒进入的能力。
通过间接ELISA测定IgG滴度，并利用替代病毒中和试验（sVNT）检测血清抑制RBD-hACE2相互作用的能力。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 蛋白生产 | pET15b 载体 | Novagen | -- |
| 大肠杆菌BL21(DE3) | Merck-Novagen | -- | |
| 异丙基-β-D-1-硫代半乳糖吡喃糖苷 | Merck-Sigma-Aldrich | -- | |
| 蛋白纯化 | PROTO300半制备C4柱 | -- | -- |
| Xbridge Protein BEH C4柱 | Waters | -- | |
| 表征 | JASCO J-720分光偏振计 | Jasco Inc | -- |
| Bruker Microflex质谱仪 | Bruker | -- | |
| Western blot | Super Signal West Pico化学发光底物 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| C-DIGIT印迹扫描仪 | LI-COR | -- | |
| 乳液制备 | 红花油 | -- | -- |
| 动物实验 | 单磷酰脂A+海藻糖二棒杆菌酸酯 | Merck Sigma-Aldrich | S6322-1VL |
| ELISA | TMB底物 | Merck-Sigma-Aldrich | P9187-50Set |
| 中和试验 | cPass SARS-CoV-2替代病毒中和试验试剂盒 | Genscript | L00847-A |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 重组蛋白生产 | 大肠杆菌菌株、质粒、诱导条件（IPTG浓度、诱导时间）、培养基成分及培养参数（温度、pH、搅拌） 阅读提示：参见Materials and methods中的“Shake flasks and bioreactor production”和“Recovery and quantification”部分 |
| 蛋白纯化 | 色谱柱类型、洗脱梯度、流速；包涵体溶解条件（变性剂、时间） 阅读提示：参见Materials and methods中的“Recombinant RBD purification”部分 |
| 口服免疫 | 小鼠品系、性别、年龄、每组数量（7只）、剂量（10 μg/只）、两次免疫间隔（15天）、给药体积（100 μL）、乳液组成及制备方法 阅读提示：参见Materials and methods中的“Animal, immunizations, and sample collection”和“Recombinant RBD and RBD-P oil-in-water emulsion formulation”部分 |
| 抗体检测 | 血清稀释度（口服1:100，肌内1:200）、包被蛋白浓度（0.5 μg/孔）、洗涤缓冲液和封闭条件；中和试验的试剂盒型号和操作步骤 阅读提示：参见Materials and methods中的“Detection of recombinant RBD and RBD-P proteins”和“In vitro serum neutralization test”部分 |