评估ACE2对TMPRSS2酶活性的影响
确定ACE2是否能改变TMPRSS2的蛋白水解活性。
使用重组人TMPRSS2和ACE2蛋白，在荧光底物存在下进行活性测定，并在不同温度（RT和37°C）及有无DX600（ACE2抑制剂）条件下监测荧光变化。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
ACE2作为气道细胞中甲型流感病毒TMPRSS2催化蛋白水解激活的新型调节因子
ACE2 acts as a novel regulator of TMPRSS2-catalyzed proteolytic activation of influenza A virus in airway cells.
实验完整度
高包含蛋白酶活性动力学测定、PPMO敲低实验、病毒复制动力学、蛋白切割分析、免疫共沉淀及ACE2缺失细胞回补实验，涵盖体外酶活和细胞模型，并有机制验证。
主要模型
Calu-3人气道上皮细胞 Caco-2人结直肠腺癌细胞 HEK293人胚肾细胞 表达TMPRSS2和ACE2的重组蛋白体系
重点核对
ACE2敲低PPMO的种类和浓度（25 µM，处理24小时） 感染病毒株（H1N1pdm、H3N2、H7N7、MERS-CoV）及MOI（低MOI 0.001和MOI 1） TMPRSS2和ACE2重组蛋白浓度（TMPRSS2 0.12 nM，ACE2 0.8 µU） ACE2抑制剂DX600使用浓度（10 µM） 病毒滴度检测方法（空斑法和TCID50）及时间点（24、48、72小时）
摘要
跨膜丝氨酸蛋白酶2（TMPRSS2）激活多种呼吸道病毒（包括甲型流感病毒（IAV）、副流感病毒和多种冠状病毒）的外部结构蛋白，以促进膜融合。既往研究表明，TMPRSS2与羧肽酶血管紧张素转换酶2（ACE2）相互作用，ACE2是某些冠状病毒的进入受体。在此，通过蛋白酶活性测定，我们确定ACE2以非催化方式增强TMPRSS2的酶活性。此外，我们证明在Calu-3人气道细胞中，ACE2敲低抑制TMPRSS2介导的IAV血凝素（HA）切割，并将病毒滴度降低100至1000倍。在ACE2缺陷细胞中瞬时表达ACE2可增强TMPRSS2介导的HA切割和IAV复制。ACE2敲低也降低了MERS-CoV的滴度，并阻止了Calu-3细胞中TMPRSS2对S蛋白的切割。相反，通常由弗林蛋白酶切割的具有多碱性HA切割位点的IAV的蛋白水解激活和多周期复制不受ACE2敲低的影响。免疫共沉淀分析揭示，ACE2-TMPRSS2相互作用需要TMPRSS2的酶活性和ACE2的羧肽酶结构域。总之，我们的数据确定ACE2是TMPRSS2活性的新辅因子或稳定剂，也是参与人气道细胞中IAV蛋白水解激活和传播的新型宿主细胞因子。此外，我们的数据表明ACE2参与TMPRSS2催化的其他呼吸道病毒（包括MERS-CoV）的激活。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- ACE2是否以及如何影响TMPRSS2介导的呼吸道病毒蛋白的蛋白水解激活？
- 核心机制
- ACE2以非催化方式增强或稳定TMPRSS2的酶活性，通过与TMPRSS2的相互作用（需要TMPRSS2的酶活性和ACE2的蛋白酶结构域）促进IAV HA和MERS-CoV S的切割。
- 主要证据
- 基于蛋白酶活性测定、Calu-3细胞中PPMO敲低ACE2、Caco-2细胞中ACE2过表达、以及免疫共沉淀等实验，显示ACE2敲低显著降低TMPRSS2介导的HA切割及病毒滴度，而过表达ACE2则增强病毒复制。
- 研究意义
- ACE2是新的TMPRSS2辅因子或稳定剂，参与IAV等呼吸道病毒的蛋白水解激活和传播，有助于阐明TMPRSS2的生理功能，并可能为广谱抗病毒药物开发提供新靶点。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
在人气道细胞中敲低ACE2并评估其对IAV复制和HA切割的影响
验证在细胞水平ACE2是否参与TMPRSS2介导的IAV激活。
使用PPMO特异性敲低Calu-3细胞中ACE2表达，感染H1N1pdm或H3N2（低MOI用于生长动力学，MOI 1用于HA切割）后，通过空斑实验分析病毒滴度，并通过western blot检测HA切割水平。同时使用H7N7（多碱性切割位点）作为对照。
验证ACE2过表达对IAV复制的影响
验证ACE2缺乏时，补充ACE2是否能增强病毒复制。
在Caco-2细胞（不表达ACE2）中瞬时转染ACE2质粒或空载体，感染H1N1pdm（MOI 0.001）后，通过空斑实验测定病毒滴度，并通过western blot检测HA切割。
分析ACE2-TMPRSS2相互作用的结构域
确定ACE2和TMPRSS2中哪些结构域介导其相互作用。
在HEK293细胞中共表达野生型或突变型ACE2（缺失PD、CD、CD+TM等）和野生型或酶活性缺失型TMPRSS2（S441A、R255Q），通过免疫共沉淀和western blot分析相互作用和切割。
评估ACE2敲低对MERS-CoV复制和S蛋白切割的影响
探讨ACE2是否也参与其他TMPRSS2底物（如MERS-CoV S）的激活。
在Calu-3细胞中用PPMO敲低ACE2，感染MERS-CoV（MOI 0.001），通过TCID50测定病毒滴度，并通过western blot检测S蛋白切割情况。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM/F-12 Ham (1:1)培养基 | Gibco | -- |
| DMEM培养基 | -- | -- | |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| 青霉素 | -- | -- | |
| 链霉素 | -- | -- | |
| 谷氨酰胺 | -- | -- | |
| 病毒扩增 | TPCK处理的胰蛋白酶 | Sigma | -- |
| 质粒构建 | Q5定点突变试剂盒 | New England Biolabs | -- |
| 基因敲低 | PPMO ACE2-AUG | Gene Tools, LLC | -- |
| PPMO ACE2-UTR | Gene Tools, LLC | -- | |
| PPMO ACE2-e5i5 | Gene Tools, LLC | -- | |
| Scramble PPMO | Gene Tools, LLC | -- | |
| 蛋白酶活性测定 | 重组人TMPRSS2 | -- | -- |
| 重组人ACE2 | Abcam | ab273297 | |
| Boc-Gln-Ala-Arg-AMC | -- | -- | |
| DX600 | Cayman Chemical | -- | |
| 血管紧张素II转换酶2活性检测试剂盒 | Abcam | ab273297 | |
| 免疫印迹 | 抗ACE2抗体 | Abcam | ab108252 |
| 抗β-actin抗体 | Abcam | ab6276 | |
| 抗H1N1pdm抗体 | Sino Biological | 11085-T62 | |
| 抗H7抗体 | Sino Biological | 40103-RP01 | |
| 抗H3抗体 | GeneTex | GTX | |
| 抗HA标签抗体 | Sigma Aldrich | H6908 | |
| 抗FLAG抗体 | Sigma Aldrich | F7425 | |
| CellLytic M细胞裂解试剂 | Sigma-Aldrich | -- | |
| PVDF膜 | GE Healthcare | -- | |
| ChemiDoc XRS+系统 | Bio-Rad | -- | |
| Image Lab软件 | Bio-Rad | -- | |
| 细胞转染 | Lipofectamine 2000转染试剂 | ThermoFisher | -- |
| 免疫共沉淀 | NP40缓冲液 | -- | -- |
| Protein-A-Sepharose树脂 | Sigma-Aldrich | -- | |
| Pierce BCA蛋白定量试剂盒 | ThermoFisher | -- | |
| 抗HA标签琼脂糖珠 | Sigma-Aldrich | -- | |
| ANTI-FLAG M2亲和凝胶 | Sigma Aldrich | -- | |
| 细胞活力检测 | CellTiter-Glo试剂盒 | -- | -- |
| 蛋白表达 | ExpiSf9细胞 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| 镍亲和树脂 | -- | -- | |
| 蛋白纯化 | Hiload 26/600 Superdex 75凝胶过滤柱 | Cytiva | -- |
| 蛋白表达 | 肠激酶 | New England Biolabs | -- |
| DH10 Bac细胞 | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| ACE2对TMPRSS2酶活性测定 | 重组TMPRSS2和ACE2的浓度及活性单位；底物浓度；DX600浓度；反应温度和时长 阅读提示：参见“Measurement of protease activities”部分，以及图2的图注 |
| 细胞培养和病毒感染 | 细胞系（Calu-3、Caco-2、HEK293）及培养条件；病毒株（H1N1pdm、H3N2、H7N7、MERS-CoV）及MOI；感染时间和孵育时间 阅读提示：参见“Cells and viruses”及“IAV infection of cells for multicycle viral replication and HA cleavage analysis”部分 |
| PPMO敲低ACE2 | PPMO序列和浓度；处理时间；敲低效率的验证方法（Western blot） 阅读提示：参见“PPMO”和“Knockdown of ACE2 expression in Calu-3 cells using PPMO”部分，以及图3A-B |
| 病毒滴度检测 | 蚀斑实验或TCID50的详细步骤；取样时间点 阅读提示：参见“IAV infection of cells for multicycle viral replication and HA cleavage analysis”及“TCID50 titration”部分 |
| 蛋白切割分析 | 细胞裂解和蛋白提取方法；使用的抗体及稀释度；SDS-PAGE和转膜的具体条件 阅读提示：参见“SDS-PAGE and western blot analysis”部分及相应图注 |
| 免疫共沉淀 | 质粒共转染比例；裂解缓冲液成分；免疫沉淀所用琼脂糖种类；洗涤和洗脱条件 阅读提示：参见“Co-immunoprecipitation assay”部分及图5 |