设计共价PLpro抑制剂系列
基于已知PLpro抑制剂结构，设计共价抑制剂以同时靶向Val70Ub位点和BL2沟槽
将Jun11313和Jun12682的活性片段融合，连接不同半胱氨酸反应性弹头，设计并合成了一系列共价PLpro抑制剂。
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基于结构的SARS-CoV-2木瓜样蛋白酶共价抑制剂的设计
Structure-Based Design of Covalent SARS-CoV-2 Papain-like Protease Inhibitors.
实验完整度
高包含生化酶活检测、细胞毒性、抗病毒药效、体内药代动力学、X射线晶体结构等多个独立证据层级，且含有机制验证（如共价结合、选择性）。
主要模型
Caco2-AT细胞（表达hACE2和hTMPRSS2） Vero E6细胞 C57BL/6J小鼠 SARS-CoV-2毒株（WA1、XBB.1.16、JN.1、rL50F/E166A/L167F）
重点核对
化合物与PLpro的共价结合位点（Cys111）及相互作用 对SARS-CoV-2 WT和变异株的抗病毒活性（EC50值） 在小鼠肝微粒体中的代谢稳定性（T1/2） 体内药代动力学参数（AUClast、Cmax） 对宿主去泛素化酶USP7和USP14的选择性
摘要
COVID-19大流行由SARS-CoV-2引起，这是一种高度传播和致病的RNA β冠状病毒。与其他RNA病毒一样，SARS-CoV-2在有或无药物选择压力的情况下持续进化，自大流行开始以来已出现许多变体。木瓜样蛋白酶PLpro是一种半胱氨酸蛋白酶，可切割病毒多蛋白以及宿主蛋白上的泛素和ISG15修饰。利用我们最近发现的PLpro中的Val70Ub结合位点，我们通过柔性连接子将半胱氨酸反应性弹头连接到联苯基PLpro抑制剂上，设计了共价PLpro抑制剂。几个先导化合物显示出有效的酶抑制活性（IC50 = 0.1 – 0.3 μM）和抗病毒活性（EC50 = 0.09 – 0.96 μM）。富马酰胺抑制剂Jun13567（15）、Jun13728（16）和Jun13714（18）在腹腔注射时显示出良好的体内药代动力学性质。PLpro与Jun13567（15）的X射线晶体结构验证了我们的设计策略，揭示了催化性Cys111与富马酰胺弹头之间的共价结合。结果表明，这些共价PLpro抑制剂是有前景的SARS-CoV-2抗病毒候选药物。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 如何设计共价PLpro抑制剂以有效抑制SARS-CoV-2复制并克服现有药物耐药性？
- 核心机制
- 抑制剂通过富马酰胺弹头与PLpro催化Cys111形成共价键，同时占据Val70Ub位点和BL2沟槽，从而抑制PLpro的蛋白酶活性和去泛素化/去ISG15化活性。
- 主要证据
- X射线晶体结构证实共价结合；生化实验显示对PLpro介导的Ub-AMC和ISG15-AMC切割有强效抑制（Ki值）；抗病毒实验显示对多种SARS-CoV-2变异株和Mpro耐药突变株有效。
- 研究意义
- 作者提出共价PLpro抑制剂是应对SARS-CoV-2变异株和Mpro抑制剂耐药性的有前途的抗病毒候选药物。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
结构-活性关系研究
评估不同弹头和连接子对化合物活性、毒性和稳定性的影响
通过FRET酶活测定IC50，Vero E6细胞中测定CC50，Caco2-AT细胞中测定抗病毒EC50，并用小鼠肝微粒体测定代谢稳定性。
机制研究
验证代表性抑制剂Jun13728对PLpro的结合和抑制机制及选择性
采用差示扫描荧光法（DSF）评估化合物与PLpro结合；用酶活实验测定对PLpro切割Ub-AMC和ISG15-AMC的Ki值；对宿主去泛素化酶USP7和USP14进行反筛选。
抗病毒活性谱
评估Jun13728对SARS-CoV-2变异株和Mpro耐药突变的抑制效果
使用斑块实验检测Jun13728对SARS-CoV-2 WT WA1、Omicron XBB.1.16和JN.1以及nirmatrelvir耐药突变株rL50F/E166A/L167F的抑制活性。
体内药代动力学评价
评估共价PLpro抑制剂在小鼠体内的药物暴露和给药途径
对代表性化合物进行快速PK研究，包括腹腔注射和口服给药，测定血浆药物浓度。
X射线晶体结构解析
确认共价抑制剂与PLpro的结合模式和共价连接位点
解析PLpro与Jun13567的共结晶结构，确定抑制剂结合模式及共价键形成。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 差示扫描荧光法 | SYPRO Orange | Invitrogen | S6650 |
| 酶活检测 | 泛素-AMC底物 | UBPBIO | M3010 |
| ISG15-AMC底物 | R&D | UL-553 | |
| 反向筛选 | USP14蛋白 | ProSci | 91-171 |
| USP7蛋白 | Sino Biological | 11681-H20B | |
| 细胞培养 | DMEM培养基 | -- | -- |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| 青霉素/链霉素 | -- | -- | |
| 嘌呤霉素 | InVivogen | ant-pr-05 | |
| 杀稻瘟菌素 | InVivogen | ant-bl-05 | |
| 细胞毒性检测 | 中性红 | -- | -- |
| 抗病毒实验 | Nano-Glo荧光素酶检测 | Promega | G9243 |
| GloMax Discover酶标仪 | Promega | GM3000 | |
| 微晶纤维素 | FMC polymers | -- | |
| 结晶紫 | -- | -- | |
| 蛋白质表达与纯化 | Miller LB培养基 | -- | -- |
| 异丙基β-D-1-硫代半乳糖吡喃糖苷 | -- | -- | |
| 蛋白质纯化 | Ni-NTA柱 | Qiagen | -- |
| TEV蛋白酶 | -- | -- | |
| Amicon Ultra-15超滤膜 | Millipore | -- | |
| Superdex 200 Increase 10/300 GL凝胶过滤柱 | GE Healthcare | -- | |
| 结晶 | Oryx8自动化结晶机器人 | Douglas Instruments Ltd | -- |
| Intelli-Plate结晶板 | Art Robbins Instruments | -- | |
| X射线衍射数据收集 | HKL2000 | -- | -- |
| Phaser | -- | -- | |
| Coot | -- | -- | |
| Phenix | -- | -- | |
| PyMOL | Schrödinger, LLC | -- | |
| 化学合成 | Biotage微波反应器 | Biotage | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 设计共价PLpro抑制剂系列 | 设计策略基于Jun11313和Jun12682结构叠加，需确认PDB代码和结合位点信息 阅读提示：Results部分图2及相关PDB条目 |
| 结构-活性关系研究 | 酶活IC50、细胞毒性CC50、抗病毒EC50、肝微粒体稳定性T1/2的具体测定条件及数值 阅读提示：Results部分图3、Table S1及Experimental Section中的Enzymatic Assays, Cytotoxicity assay, Antiviral assays, Liver Microsome Metabolic Stability Assay |
| 机制研究 | DSF实验条件、酶活测定条件（PLpro浓度、底物浓度）、USP7/USP14反筛选浓度 阅读提示：Results部分图4及Experimental Section中的Differential Scanning Fluorimetry, Enzymatic Assays |
| 抗病毒活性谱 | 细胞系、病毒株、MOI、孵育时间、化合物浓度范围 阅读提示：Results部分图5及Experimental Section中的Antiviral assays with live SARS-CoV-2 |
| 体内药代动力学评价 | 动物品系、性别、年龄、体重、给药途径、剂量、赋形剂、采血时间点、分析参数 阅读提示：Results部分图6及Experimental Section中的In vivo snap PK studies, Plasma sample analysis, PK data analysis |
| X射线晶体结构解析 | 蛋白浓度、摩尔比、结晶条件、数据收集与处理软件、PDB代码 阅读提示：Results部分图7-8及Experimental Section中的Crystallization and data collection, Structure determination and Refinement |