检测Juno/Izumo1相互作用以开发Cell-Int
验证Cell-Int能否检测已知膜蛋白相互作用
293-F细胞分别共转染Juno+GFP或Izumo1+RFP，混合孵育后流式检测双阳性事件。优化温度、时间、敏感性。
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Cell-Int: 一种鉴定天然膜蛋白相互作用的细胞间相互作用测定法
Cell-Int: a cell-cell interaction assay to identify native membrane protein interactions.
实验完整度
高包含方法开发、多种已知蛋白对验证、ORFeome库筛选、HLA-G异构体网络分析、阻断抗体抑制实验及可溶性蛋白结合验证等多个独立证据层级，并包含功能验证。
主要模型
FreeStyle 293-F细胞 K562细胞 WOP细胞 Raji细胞
重点核对
293-F细胞共转染膜蛋白和荧光蛋白，共孵育1-2小时，25°C ORFeome库筛选使用163个cDNA池，每池平均87个ORF，阳性池需经亚克隆验证 HLA-G1与LILRB1/2相互作用依赖β2m共表达 阻断抗体预孵育45分钟，25°C，浓度范围2 ng/ml至0.1 mg/ml
摘要
一种用于在准生理条件下研究膜蛋白相互作用的细胞相互作用测定法，具有多种应用，从解析相互作用网络到评估治疗分子。细胞间蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）在生物学功能和疾病中具有关键作用。因此，膜蛋白是药物靶点的主要类别。然而，由于膜蛋白的特性，研究此类细胞间PPI具有挑战性。目前的方法通常使用纯化或修饰的蛋白，这些蛋白不具有生理相关性，因此可能错误表征体内发生的相互作用。在此，我们描述了Cell-Int：一种用于研究质膜PPI的细胞相互作用测定法。通过表达配体或受体的两群细胞之间形成缀合物来测量相互作用信号。在这些设置中，膜蛋白处于其天然环境中，因此具有生理相关性。Cell-Int已应用于多种蛋白伴侣的研究，并能研究阻断抗体的抑制潜力，以及融合蛋白的重新靶向用于治疗开发。该测定法也经过验证适用于筛选应用，并可作为鉴定新蛋白相互作用物的平台。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 如何开发一种能在准生理条件下研究质膜蛋白-蛋白相互作用的细胞测定法，并验证其广泛适用性？
- 核心机制
- Cell-Int通过共表达膜蛋白的293-F细胞形成缀合物，信号由流式检测双阳性事件，能特异性检测多种膜蛋白相互作用，且HLA-G1与LILRB1/2的相互作用需要β2m。
- 主要证据
- 通过Juno/Izumo1验证，多种免疫和病毒蛋白对检测，ORFeome库筛选发现LILRB1，HLA-G异构体网络分析及抗体抑制实验支持。
- 研究意义
- Cell-Int可用于筛选新膜蛋白相互作用、评估阻断抗体抑制潜力、验证病毒靶向策略，有助于理解膜相互作用组及治疗性调节。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
验证Cell-Int检测多种受体-配体对
测试不同生物过程中的受体-配体相互作用
分别检测PD-1/PD-L1、PD-1/PD-L2、CTLA-4/CD80、CD200/CD200R1、PILRα/NPDC-1、病毒糖蛋白与受体、CAR介导的相互作用。
筛选HLA-G1的相互作用配体
利用Cell-Int从ORFeome库中鉴定HLA-G1的膜蛋白相互作用物
使用163个cDNA池转染293-F细胞，与HLA-G1/β2m+GFP细胞共孵育，流式检测阳性池，迭代亚克隆，最后测序鉴定LILRB1。
分析HLA-G1及其异构体与受体相互作用网络
确定HLA-G1-4膜结合异构体与已知受体的相互作用，并检验β2m的作用
使用Cell-Int在293-F、K562、WOP细胞中测试HLA-G异构体与LILRB1/2、KIR2DL4、CD160、CD8的相互作用，并用可溶性受体结合实验验证。
评估阻断抗体的抑制活性
测试Cell-Int能否用于衡量治疗性抗体的抑制效果
用不同浓度nivolumab、atezolizumab、cetuximab和抗LILRB1抗体预孵育靶蛋白表达细胞，然后加入配体表达细胞，测量双阳性事件，计算IC50。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| 胎牛血清 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 链霉素 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 青霉素 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| FreeStyle 293-F细胞 | Thermo Fisher Scientific | R79007 | |
| FreeStyle 293表达培养基 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| RPMI 1640培养基 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 聚凝胺 | -- | -- | |
| 潮霉素 | Dutscher | 702642 | |
| jetPRIME转染试剂 | Ozyme | -- | |
| 细胞转染 | FectoPro转染试剂 | Polyplus | -- |
| 流式分析 | CytoFLEX流式细胞仪 | Beckman Coulter | -- |
| LSRFortessa II流式细胞仪 | BD Biosciences | -- | |
| 细胞分选 | FACSAria Fusion细胞分选仪 | BD Biosciences | -- |
| 显微镜 | EVOS M5000荧光显微镜 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| 抗体生产 | AKTA蛋白纯化仪 | -- | -- |
| Pierce LAL显色内毒素定量试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 质粒提取 | NucleoSpin质粒提取试剂盒 | Macherey-Nagel | 740588.250 |
| 分子克隆 | LR Clonase II重组酶 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| Western blot | Agilent 2100生物分析仪 | Agilent | -- |
| 流式染色 | 抗Juno PE抗体 | BioLegend | 125007 |
| 抗Izumo1抗体 | antibodies-online | ABIN2452040 | |
| 抗大鼠AF488二抗 | Thermo Fisher Scientific | A-21208 | |
| 抗PD-1 PE抗体 | BioLegend | 621608 | |
| 抗PD-L1 PE抗体 | BioLegend | 329706 | |
| 抗PD-L2 BUV496抗体 | BD Biosciences | 750163 | |
| 抗CTLA-4 APC抗体 | Miltenyi Biotec | 130-116-931 | |
| 抗CD80 PE抗体 | BioLegend | 305207 | |
| 抗CD200抗体 | BD Biosciences | 552475 | |
| 抗CD200R1L抗体 | Sino Biological | 11620-MM09 | |
| 抗小鼠AF488二抗 | Thermo Fisher Scientific | A32723 | |
| 抗PILRα PE抗体 | Bio-Techne | FAB6484P | |
| 抗PILRβ PE抗体 | Bio-Techne | FAB4189P | |
| 抗EGFR FITC抗体 | Bio-Rad | MCA1784F | |
| 抗erbB-2 AF647抗体 | BioLegend | 324412 | |
| 抗Penta-His AF647抗体 | QIAGEN | 35370 | |
| 抗LILRB1 PE抗体 | BioLegend | 333708 | |
| 抗LILRB2 PE抗体 | Invitrogen | 12-5149-42 | |
| 抗KIR2DL4 PE抗体 | R&D Systems | FAB2238P | |
| 抗CD160 PE抗体 | Invitrogen | 12-1609-42 | |
| 抗CD8 FITC抗体 | Beckman Coulter | A07756 | |
| PE偶联抗HLA-G抗体 | Exbio | MEM-G/9, 1P-292-C100 | |
| PE偶联抗β2m抗体 | BioLegend | 395704 | |
| AF647偶联抗HLA-G抗体 | Santa Cruz Biotechnology | 4H84, sc-21-799 AF647 | |
| PE偶联抗CD20抗体 | BioLegend | 302306 | |
| 抗体药物 | 纳武利尤单抗 | CliniSciences | HY-P9903 |
| 阿替利珠单抗 | CliniSciences | HY-P9904 | |
| 西妥昔单抗 | CliniSciences | HY-P9905 | |
| 抗体生产 | LILRB1-Fc融合蛋白 | -- | -- |
| 流式染色 | Hoechst染料 | Life Technologies | H3570 |
| 结合实验 | 山羊抗人IgG H+L Alexa Fluor 488偶联物 | Invitrogen | A-11013 |
| 小鼠抗Penta-His Alexa Fluor 647偶联物 | QIAGEN | 1019252 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养 | 293-F细胞培养密度、CO2浓度、转速；WOP、K562、Raji培养基成分 阅读提示：Methods: Cell lines |
| 细胞转染 | 转染试剂、DNA比例、细胞密度；LILRB2载体稀释倍数 阅读提示：Methods: Cell interaction assay (Cell-Int) |
| 共孵育 | 共孵育温度、时间、细胞比例、培养基 阅读提示：Methods: Cell interaction assay (Cell-Int) |
| 筛选 | cDNA池数量、每池ORF数、阳性池亚克隆策略、阈值定义 阅读提示：Methods: cDNA library screening and subcloning |
| 抗体抑制实验 | 抗体浓度范围、预孵育时间、温度、IC50计算方法 阅读提示：Methods: Cell interaction assay (Cell-Int) |
| 结合实验 | 可溶性受体浓度、孵育时间、检测抗体 阅读提示：Methods: Binding assay |