抗体筛选与制备
从噬菌体展示文库中筛选靶向H1N1 NA的单链抗体，并转化为全长IgG。
利用CA/09 NA进行三轮淘选，ELISA鉴定阳性克隆，选出FNA1 scFv，克隆到pFRT-IgG1κ载体，在ExpiCHO细胞中瞬时表达并纯化。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
识别流感病毒N1神经氨酸酶的抗体的开发与表征
Development and characterization of an antibody that recognizes influenza virus N1 neuraminidases.
实验完整度
中研究包含体外抗体筛选、结合活性、功能验证和表位初步鉴定，但缺乏体内保护实验且假病毒功能验证有限。
主要模型
MDCK细胞和293T细胞 H5N1假病毒系统
重点核对
FNA1 mAb与CA/09 NA和Anh05 NA的结合特异性（ELISA、Western blot、流式细胞术） FNA1 mAb对CA/09 NA和Anh05 NA的酶活性抑制（ELLA） FNA1 mAb对H5N1假病毒释放的阻断作用 FNA1 mAb与NA突变体结合流式细胞术确定关键残基
摘要
甲型流感病毒（IAVs）持续对公共卫生构成巨大威胁，其预防和治疗仍然是重大的国际问题。神经氨酸酶（NA）是流感病毒表面第二丰富的糖蛋白，针对NA的抗体已被证明对流感感染有效。在本研究中，我们制备了一种名为FNA1的单克隆抗体（mAb），靶向N1 NA。FNA1与H1N1和H5N1 NA反应，但不与H3N2和H7N9的NA蛋白反应。在体外，FNA1显示出有效的抗病毒活性，既介导NA抑制（NI），也阻断假病毒释放。此外，NA蛋白中的第219、254、358和388位残基对FNA1与H1N1 NA的结合至关重要。然而，尚需进一步验证以确认FNA1 mAb是否确实是针对NA的良好抑制剂，可用于H1N1和H5N1病毒的应用。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 开发并表征一种能够识别N1亚型流感病毒神经氨酸酶的单克隆抗体，并评估其抗病毒活性。
- 核心机制
- FNA1通过结合NA蛋白的特定残基（W219、K254、W358、S388），通过空间位阻阻断神经氨酸酶活性位点对底物的接触，从而抑制NA酶活性。
- 主要证据
- ELISA和Western blot显示FNA1与H1N1和H5N1 NA结合；ELLA实验显示FNA1抑制CA/09 NA和Anh05 NA的酶活性（IC50分别为0.06和2.88 μg/mL）；假病毒释放实验显示FNA1阻断Anh05假病毒释放；点突变和流式细胞术鉴定出关键残基。
- 研究意义
- FNA1作为N1 NA的特异性抗体，有望成为流感治疗的候选药物。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
抗体结合特异性验证
验证FNA1 mAb与不同亚型NA蛋白的结合特异性和亲和力。
通过ELISA和Western blot检测FNA1与H1N1、H3N2、H5N1、H7N9 NA的结合；利用流式细胞术检测与293T细胞表面表达的NA的结合；通过BLI测定亲和力。
神经氨酸酶抑制活性测定
检测FNA1 mAb对NA酶活性的抑制作用。
利用ELLA和NA-XTD实验检测FNA1对CA/09 NA、Anh05 NA和Anh05假病毒的酶活性抑制。
假病毒释放抑制实验
检测FNA1 mAb是否阻断包膜假病毒从细胞释放。
共转染HA、NA和包装质粒包装Anh05假病毒，转染后6小时加入FNA1 mAb，48小时后检测释放的假病毒感染293T细胞的能力。
表位初步鉴定
确定FNA1 mAb与H1N1 NA结合的关键氨基酸残基。
选择35个可能的突变位点，通过定点突变构建NA突变体，转染293T细胞后利用流式细胞术检测FNA1与突变体的结合。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | 杜氏改良Eagle培养基 | Gibco | -- |
| 胎牛血清 | Gibco | -- | |
| 重组蛋白 | 重组H1N1 NA蛋白 | Sino Biological | 11058-V08B |
| 重组H3N2 NA蛋白 | Sino Biological | 40569-V07H | |
| 重组H5N1 NA蛋白 | Sino Biological | 11676-V08B | |
| 重组H7N9 NA蛋白 | Sino Biological | 40108-V07H | |
| 噬菌体淘选 | 免疫管 | Bio-view shine | -- |
| 抗体生产 | ExpiFectamine CHO转染试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | A29133 |
| HiTrap rProtein A FF 层析柱 | Cytiva | 17507901 | |
| 抗体纯度分析 | Bis-Tris凝胶 | GenScript | M00653 |
| ELISA | 辣根过氧化物酶标记的抗人IgG | SeraCare | 5220-0330 |
| Western blot | 聚偏二氟乙烯膜 | Merck | IPVH00010 |
| eBlot L1快速湿转系统 | GenScript | -- | |
| 增强型化学发光底物 | PerkinElmer | NEL105001EA | |
| 流式细胞术 | Lipo3000转染试剂 | Thermo Fisher Scientific | L3000015 |
| 抗人kappa轻链二抗 | Thermo Fisher Scientific | 12-9970-42 | |
| 亲和力测定 | ForteBio Octet系统 | Sartorius | -- |
| 假病毒生产 | 0.45 μm滤器 | Merck | SLHV033RB |
| 30 KD离心过滤器 | Merck | UFC903096 | |
| 假病毒滴定 | 荧光素酶底物 | Promega | E1910 |
| NEU活性抑制 | 胎球蛋白 | Sigma | SRP3283 |
| HRP标记的花生凝集素 | Sigma | L7759 | |
| NA酶活性检测 | NA-XTD检测试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | 4457535 |
| 定点突变 | 快速定点突变试剂盒 | TIANGEN | KM101 |
| 数据分析 | GraphPad Prism软件 | -- | -- |
| FlowJo软件 | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养 | MDCK和293T细胞培养条件：含10% FBS的DMEM，37°C、5% CO2 阅读提示：见Methods中的Cells and recombinant proteins |
| 重组蛋白 | 重组NA蛋白来源及货号：Sino Biological，CA/09 (11058-V08B)、H3N2 (40569-V07H)、Anh05 (11676-V08B)、H7N9 (40108-V07H) 阅读提示：见Methods中的Cells and recombinant proteins |
| 抗体结合实验（ELISA/Western blot） | FNA1 mAb起始浓度5 μg/mL，包被NA蛋白浓度2 μg/mL 阅读提示：见Methods中的ELISA和Western blot |
| 神经氨酸酶抑制实验（ELLA） | Anh05假病毒使用浓度（滴度2.59×10^5 TCID50/mL），CA/09 NA浓度25 μg/mL，Anh05 NA浓度0.5 μg/mL，FNA1起始浓度100 μg/mL 阅读提示：见Methods中的NA enzyme-linked lectin assay (ELLA) |
| 假病毒释放抑制实验 | 质粒比例1:1:2，FNA1浓度5和50 μg/mL，转染后6小时加抗体 阅读提示：见Materials and methods中的In vitro inhibition of pseudovirus release by FNA1 mAb |