体外表达验证
验证合成的mRNA在细胞中能否正确表达HA蛋白并正确定位到细胞表面。
将编码H1N1 HA的mRNA转染HEK293细胞，通过免疫细胞化学染色检测细胞内和细胞表面的HA蛋白表达。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
针对季节性流感的具有交叉特异性体液免疫反应的三价mRNA候选疫苗
Trivalent mRNA vaccine-candidate against seasonal flu with cross-specific humoral immune response.
实验完整度
高包含体外表达验证（HEK293细胞转染）、小鼠免疫原性试验（HAI、ELISA）以及致死性病毒感染保护实验，形成多层级证据链。
主要模型
BALB/c小鼠 HEK293细胞
重点核对
疫苗剂量：每剂15 μg mRNA（每种HA mRNA各5 μg） 免疫方案：两次肌肉注射，间隔14天 攻毒模型：25 LD50小鼠适应H1N1 A/Victoria/2570/2019病毒 检测方法：HAI试验、ELISA、RT-qPCR
摘要
季节性流感仍然是一个严重的全球健康问题，导致老年人和患有合并症的人群死亡率很高。疫苗接种通常被认为是预防流感最有效的策略。虽然目前的流感疫苗是有效的，但它们仍然有局限性，包括对某些血清学变异的特异性狭窄，这可能导致疫苗抗原与流行毒株不匹配。此外，病毒的快速变异性对提供超过一个季节的延长保护提出了挑战。因此，mRNA技术特别有希望用于流感预防，因为它能够快速开发多价疫苗，并允许快速更新其抗原组成。mRNA疫苗已经通过引发快速的细胞和体液免疫反应，在预防COVID-19方面证明是成功的。在这项研究中，我们展示了一种三价mRNA疫苗候选物的开发，使用血凝抑制试验、ELISA评估其免疫原性，并评估其在动物中的功效。我们证明了mRNA疫苗候选物相比灭活裂解流感疫苗具有更高的免疫原性，以及其产生交叉特异性体液免疫反应的增强能力。这些发现强调了mRNA技术在克服当前流感疫苗局限性方面的潜力，并有望确保在预防季节性流感爆发方面具有更大的功效。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- mRNA疫苗平台能否诱导针对季节性流感病毒的广谱免疫反应，并与传统裂解疫苗相比具有优势？
- 核心机制
- mRNA疫苗能够诱导更高水平的针对血凝素保守结构域（茎部）的抗体，这可能解释了其交叉反应性。
- 主要证据
- 在小鼠模型中进行两次免疫后，通过HAI和ELISA检测到针对同源和异源流感病毒株的高滴度抗体，并在致死性攻毒实验中提供完全保护，与裂解疫苗相比具有更低的肺病毒载量和更好的生存率。
- 研究意义
- mRNA技术为开发能够提供更广谱保护的流感疫苗提供了潜力，有助于克服当前疫苗的局限性，并为应对季节性流感爆发提供更有效的保障。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
小鼠免疫原性评价
评估三价mRNA疫苗候选物在小鼠中诱导血凝抑制抗体的能力。
BALB/c小鼠通过肌肉注射接受两次疫苗免疫，间隔14天，在免疫后第7、21、35天采集血清，用HAI试验检测针对疫苗株和异源株的抗体滴度。
交叉反应性分析
评估mRNA疫苗诱导的抗体对异源流感病毒株的交叉反应性。
使用末次免疫后21天的血清，通过HAI试验检测对多种H1N1、H3N2和B型流感病毒株的反应性，并用ELISA检测针对HA头部和茎部结构域的抗体水平。
攻毒保护实验
评估疫苗在致死性流感病毒感染模型中的保护效力。
免疫小鼠在二次免疫后14天，通过鼻内感染25 LD50的小鼠适应H1N1 A/Victoria/2570/2019病毒，监测存活率、体重变化，并在感染后第3天检测肺病毒载量。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证样本或模型特征
验证机制链路
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| mRNA生产 | pJAZZ-OK线性质粒 | Lucigen | -- |
| 质粒大提试剂盒 | QIAGEN | -- | |
| BsmBI-v2限制性内切酶 | NEB | -- | |
| T7 RNA聚合酶 | Biolabmix | -- | |
| 三核苷酸帽1类似物 | Biolabmix | -- | |
| N1-甲基假尿苷三磷酸 | Biolabmix | -- | |
| 脱氧核糖核酸酶I | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| mRNA-LNP装配 | 可电离脂质ALC-0315 | Cayman Chemicals | -- |
| PEG脂质ALC-0159 | Cayman Chemicals | -- | |
| NanoAssemblr Ignite微流控装置 | Precision NanoSystems | -- | |
| Slide-A-Lyzer透析卡 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| mRNA-LNP表征 | Zetasizer Nano ZS粒度仪 | Malvern Panalytical | -- |
| SYBR Green I染料 | Lumiprobe | -- | |
| Varioscan LUX荧光酶标仪 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Paneco | -- |
| L-谷氨酰胺 | Gibco | -- | |
| 胎牛血清 | HyClone | -- | |
| 青霉素 | Paneco | -- | |
| 链霉素 | Paneco | -- | |
| 细胞转染 | Lipofectamine 3000转染试剂 | Invitrogen | -- |
| Opti-Mem I减血清培养基 | Gibco | -- | |
| 免疫细胞化学 | 抗流感A病毒抗体 | Chemicon/Sigma-Aldrich | #AB1074 |
| 驴抗山羊IgG H&L（Alexa Fluor 488） | Abcam | ab150133 | |
| DAPI染色液 | -- | -- | |
| ZOE荧光细胞成像仪 | Bio-Rad | -- | |
| HAI试验 | 受体破坏酶 | Denka Seiken | -- |
| ELISA | 重组HA茎部结构域 | -- | -- |
| HA头部结构域 | Sino Biological | 11055-V08H4 | |
| 辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠IgG | HyTest | L20/01 | |
| S002X缓冲液 | Xema | -- | |
| ELISA缓冲液S011 | Xema | -- | |
| 显色底物溶液R055 | Xema | -- | |
| 洗涤缓冲液S008 | Xema | -- | |
| Multiscan FC酶标仪 | Thermo Scientific | -- | |
| 病毒载量检测 | ExtractRNA试剂 | Eurogen | -- |
| 2xBioMaster RT-PCR-RT预混液 | Biolabmix | -- | |
| CFX96 Touch实时荧光定量PCR仪 | Bio-Rad | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| mRNA制备 | IVT反应成分（T7 RNA聚合酶、帽类似物、m1ΨTP等）和条件（37°C孵育2小时） 阅读提示：Methods 2.1 |
| LNP制备 | 脂质摩尔比、N:P比（6）、mRNA浓度（0.2 mg/mL）、微流控参数 阅读提示：Methods 2.2 |
| 免疫方案 | 小鼠品系和年龄、疫苗剂量、注射途径（肌肉）、两次免疫间隔（14天） 阅读提示：Methods 2.7, Figure 3A |
| 攻毒方案 | 攻毒病毒株（小鼠适应A/Victoria/2570/2019）、剂量（25 LD50）、麻醉剂（Zoletil-Xylazine）、观察时间（10天） 阅读提示：Methods 2.10, Figure 6A |
| 病毒载量检测 | 取样时间（攻毒后第3天）、肺匀浆制备、RT-qPCR条件（引物、探针、循环条件） 阅读提示：Methods 2.11 |