靶向两种不同CD73表位的抗体鸡尾酒增强酶抑制和肿瘤控制

An antibody cocktail targeting two different CD73 epitopes enhances enzyme inhibition and tumor control.

作者信息Jin-Gen Xu, Shi Chen, Yang He, Xi Zhu, Yanting Wang, Zhifeng Ye, Jin Chuan Zhou, Xuanhui Wu, Lei Zhang, Xiaochen Ren, Huifeng Jia, Haijia Yu, Xiaoyue Wei, Yujie Feng, Xiaofang Chen, Xiaopei Cui, Xianfei Pan, Shaojie Wang, Simin Xia, Hongjie Shang, Yueqing Pu, Wei Xu, Haidong Li, Qian Chen, Zeyu Chen, Manfu Wang, Xiaodong Yan, Hui Shi, Mingwei Li, Yisui Xia, Roberto Bellelli, Shunli Dong, Jun He, Jun Huang, Chen-Leng Cai, Xiangyang Zhu, Yifan Zhan, Li Wan

PMID39738003

期刊Nat Commun

发布时间2024-12-30

DOI10.1038/s41467-024-55207-9

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实验完整度

高

包含体外酶活抑制、T细胞增殖、HDX-MS表位定位、冷冻电镜结构解析、多种动物模型体内药效及药代动力学研究，证据层级丰富。

主要模型

CHO-K1细胞稳定过表达人CD73 MDA-MB-231三阴性乳腺癌异种移植模型 BxPC-3胰腺癌异种移植模型 HepG2肝癌异种移植模型

重点核对

HB0045为HB0038和HB0039的1:1混合物体外酶抑制实验使用可溶性CD73和膜结合CD73 T细胞增殖实验使用人PBMC 体内实验使用NPG、NCG、C-NKG免疫缺陷小鼠 PDX模型肿瘤样本编号为050125

摘要

CD73是一种负责产生腺苷的胞外酶，在免疫抑制的肿瘤环境中常常升高。抑制CD73活性作为CD73表达癌症的治疗策略具有巨大前景。在本研究中，我们开发了一种治疗性抗人CD73抗体鸡尾酒HB0045。HB0045是由两种人源化单克隆IgG1抗体HB0038和HB0039按1:1比例混合而成。该鸡尾酒不仅利用了其亲本抗体在酶抑制方面的优势，而且在体外表现出显著更强的促进T细胞增殖的能力。结构分析表明，HB0045通过双重锁定机制有效地将CD73二聚体锁定在“部分开放”的非活性构象中。在同系和异种移植肿瘤的各种动物模型中，HB0045比单一抗体更有效地抑制肿瘤生长。总的来说，我们的发现为CD73靶向抗体鸡尾酒的机制提供了功能和结构上的见解。

抗CD73单抗的筛选与人源化

获得靶向CD73不同表位、具有良好结合和抑制活性的抗体克隆。

通过杂交瘤技术产生约3000个抗CD73抗体，经结合、酶活抑制、稳定性筛选，选择HB0038和HB0039进行人源化，并引入L234A/L235A突变降低效应功能。

HB0038和HB0039的表位鉴定

确定HB0038和HB0039在CD73上的结合表位，验证其非竞争性。

采用HDX-MS鉴定表位，并通过丙氨酸扫描突变和SPR验证关键残基。

体外酶活抑制和免疫细胞增殖实验

评估HB0045及其亲本抗体对CD73酶活性的抑制能力及对T细胞增殖的影响。

通过检测可溶性CD73、膜结合CD73及混合形式的酶活性抑制，以及ATP或AMP介导的T细胞增殖恢复实验。

结构解析（负染EM和冷冻电镜）

解析HB0045与CD73复合物的结构，揭示双重锁定机制。

先进行负染EM观察HB0038 Fab-HB0039 IgG-CD73复合物，再通过冷冻电镜解析CD73-HB0038 Fab-HB0039 Fab三元复合物，分辨率为3.06 Å。

分子动力学模拟

模拟HB0045结合后CD73的构象稳定性，验证“部分开放”构象。

基于冷冻电镜结构，对apo-CD73及与HB0038、HB0039、HB0045结合的复合物进行50 ns的分子动力学模拟，分析RMSD和RMSF。

体内抗肿瘤药效评估

评估HB0045在多种肿瘤模型中的抗肿瘤效果。

在PBMC人源化NPG小鼠中建立MDA-MB-231、BxPC-3、A375异种移植模型，在NCG小鼠中建立HepG2模型，在C-NKG小鼠中建立PDX模型，比较HB0045与亲本抗体及对照的治疗效果。

药代动力学分析

评估HB0045及其亲本抗体在体内的药代动力学特性。

NPG小鼠单次腹腔注射不同剂量抗体，在不同时间点采血，通过ELISA检测血清浓度，计算半衰期和Cmax。

实验环节	名称	品牌	货号
抗体表达与纯化	蛋白A层析柱	Cytiva	--
Poros XQ 树脂	Thermo Fisher	--
结合动力学分析	Biacore 8K 系统	Cytiva	--
Series S 传感芯片 Protein A	Cytiva	29127556
HBS-EP 运行缓冲液	Cytiva	BR100669
甘氨酸	Cytiva	BR100354
细胞膜结合实验	PE偶联山羊抗人Fcγ抗体	Jackson	109-115-098
细胞培养	RPMI 1640培养基	Corning	10-040-CVR
DMEM培养基	GIBCO	10-013-CVR
胎牛血清	Gibco	10270-106
基质胶	--	--
酶活抑制实验	CellTiter-Glo 试剂	Promega	G7573
腺苷一磷酸	Sigma	1930
三磷酸腺苷	Sigma	A6419
T细胞增殖实验	Cell Trace Violet 染料	Thermo Fisher Scientific	C34557
抗CD3抗体	Biolegend	317326
抗CD28抗体	Thermo Fisher Scientific	14-0289-82
白细胞介素-7	R&D	207-IL-010
碘化丙啶	Sigma	P4170
流式分析	APC-cy7抗人CD4抗体	Biolegend	317418
BV510抗人CD8抗体	Biolegend	344732
FITC抗人CD4抗体	BioLegend	317408
APC抗人CD8抗体	BioLegend	344722
内化实验	pHAb 染料	Promega	G9845
FITC抗hCD4抗体	Thermo Fisher Scientific	11-0049-42
eFluor抗hCD8抗体	Thermo Fisher Scientific	48-0088-42
负染EM	TF20 电镜	FEI Company	--
冷冻电镜	Titan Krios 电镜	Thermo Fisher Scientific	--
K3 直接电子探测器	Gatan	--
Quantifoil R 1.2/1.3 300M Au 载网	--	--
动物实验	异氟烷	--	--

实验环节

名称

品牌

货号

抗体表达与纯化

蛋白A层析柱

Cytiva

Poros XQ 树脂

Thermo Fisher

结合动力学分析

Biacore 8K 系统

Cytiva

Series S 传感芯片 Protein A

Cytiva

29127556

HBS-EP 运行缓冲液

Cytiva

BR100669

甘氨酸

Cytiva

BR100354

细胞膜结合实验

PE偶联山羊抗人Fcγ抗体

Jackson

109-115-098

细胞培养

RPMI 1640培养基

Corning

10-040-CVR

DMEM培养基

GIBCO

10-013-CVR

胎牛血清

Gibco

10270-106

基质胶

酶活抑制实验

CellTiter-Glo 试剂

Promega

G7573

腺苷一磷酸

Sigma

1930

三磷酸腺苷

Sigma

A6419

T细胞增殖实验

Cell Trace Violet 染料

Thermo Fisher Scientific

C34557

抗CD3抗体

Biolegend

317326

抗CD28抗体

Thermo Fisher Scientific

14-0289-82

白细胞介素-7

R&D

207-IL-010

碘化丙啶

Sigma

P4170

流式分析

APC-cy7抗人CD4抗体

Biolegend

317418

BV510抗人CD8抗体

Biolegend

344732

FITC抗人CD4抗体

BioLegend

317408

APC抗人CD8抗体

BioLegend

344722

内化实验

pHAb 染料

Promega

G9845

FITC抗hCD4抗体

Thermo Fisher Scientific

11-0049-42

eFluor抗hCD8抗体

Thermo Fisher Scientific

48-0088-42

负染EM

TF20 电镜

FEI Company

冷冻电镜

Titan Krios 电镜

Thermo Fisher Scientific

K3 直接电子探测器

Gatan

Quantifoil R 1.2/1.3 300M Au 载网

动物实验

异氟烷

环节	核对要点
抗体鸡尾酒制备	HB0045为HB0038和HB0039的1:1混合物；抗体表达系统（CHO-S或CHO-K1）；纯化方法（蛋白A和阴离子交换层析）阅读提示：Methods中'Generation, expression, and purification of HB0038, HB0039 and HB0045'
酶活抑制实验	可溶性CD73浓度1 μg/ml；抗体稀释倍数；反应时间（30 min）和温度（20°C）；底物ATP和AMP浓度（200 μM/600 μM）阅读提示：Methods中'Blockade of recombinant soluble CD73 enzymatic activity'
T细胞增殖实验	PBMC来源（Milestone Biotechnologies）；细胞密度1×10^5/孔；抗CD3和抗CD28浓度（1 μg/ml）；IL-7浓度（10 ng/ml）；ATP浓度200 μM或AMP浓度800 μM；抗体孵育30 min 阅读提示：Methods中'HB0045 alleviated ATP-mediated inhibition of T-cell proliferation'和'Anti-CD73 antibodies alleviated AMP-mediated inhibition of T-cell proliferation'
体内药效实验	小鼠品系（NPG、NCG、C-NKG）；细胞接种量（5×10^6或3×10^6）；PBMC数量（1×10^7）；给药剂量（1、3、5、10、20、40 mg/kg）；给药频率（每周两次）；疗程（4周或3周）阅读提示：Methods中'Drug efficacy assays on subcutaneous xenograft models in human PBMC-humanized Prkdcscid Il2rgnull (NPG) mice'等
冷冻电镜样品制备	蛋白浓度（0.6 μM）；载网类型（Quantifoil R 1.2/1.3 300M Au）；块状时间（3 s）和力量（0）；温度（4°C）和湿度（100%）阅读提示：Methods中'Single particle cryogenic EM of CD73-HB0038 Fab-HB0039 Fab complex'

环节

核对要点

抗体鸡尾酒制备

HB0045为HB0038和HB0039的1:1混合物；抗体表达系统（CHO-S或CHO-K1）；纯化方法（蛋白A和阴离子交换层析）

阅读提示：Methods中'Generation, expression, and purification of HB0038, HB0039 and HB0045'

酶活抑制实验

可溶性CD73浓度1 μg/ml；抗体稀释倍数；反应时间（30 min）和温度（20°C）；底物ATP和AMP浓度（200 μM/600 μM）

阅读提示：Methods中'Blockade of recombinant soluble CD73 enzymatic activity'

T细胞增殖实验

PBMC来源（Milestone Biotechnologies）；细胞密度1×10^5/孔；抗CD3和抗CD28浓度（1 μg/ml）；IL-7浓度（10 ng/ml）；ATP浓度200 μM或AMP浓度800 μM；抗体孵育30 min

阅读提示：Methods中'HB0045 alleviated ATP-mediated inhibition of T-cell proliferation'和'Anti-CD73 antibodies alleviated AMP-mediated inhibition of T-cell proliferation'

体内药效实验

小鼠品系（NPG、NCG、C-NKG）；细胞接种量（5×10^6或3×10^6）；PBMC数量（1×10^7）；给药剂量（1、3、5、10、20、40 mg/kg）；给药频率（每周两次）；疗程（4周或3周）

阅读提示：Methods中'Drug efficacy assays on subcutaneous xenograft models in human PBMC-humanized Prkdcscid Il2rgnull (NPG) mice'等

冷冻电镜样品制备

蛋白浓度（0.6 μM）；载网类型（Quantifoil R 1.2/1.3 300M Au）；块状时间（3 s）和力量（0）；温度（4°C）和湿度（100%）

阅读提示：Methods中'Single particle cryogenic EM of CD73-HB0038 Fab-HB0039 Fab complex'

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