滑液样本收集与处理
获取用于验证实验的临床滑液样本。
从膝关节退行性病变患者中收集22份滑液样本,分装于0.5 mL Eppendorf管中,储存于-80°C直至分析。
Validation of a rapid collagenase activity detection technique based on fluorescent quenched gelatin with synovial fluid samples.
包含22例滑液样本的抗体微阵列定量和明胶酶活性检测,并用Pearson相关性验证两种方法的一致性,但缺乏动物模型或功能机制验证。
人滑液样本(22例,来自膝关节退行性病变患者) 抗体微阵列 明胶-FITC荧光检测体系
滑液样本数量为22例 滑液样本储存条件:-80°C 抗体微阵列中抗MMP-9抗体浓度:200 μg/mL 明胶-FITC检测中酶孵育缓冲液成分:50 mM Tris HCl, 150 mM NaCl, 5 mM CaCl2, 0.01% Tween, pH 7.6 荧光读取参数:485/540 nm,37°C,20分钟,每2分钟读取一次
提炼研究问题、关键发现与证据,快速把握文章的核心贡献。
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
获取用于验证实验的临床滑液样本。
从膝关节退行性病变患者中收集22份滑液样本,分装于0.5 mL Eppendorf管中,储存于-80°C直至分析。
确定滑液样本中MMP-9的浓度。
使用抗体微阵列技术,将抗MMP-9抗体打印在玻璃片上,与样本孵育,再与荧光标记二抗孵育,通过扫描仪测量荧光信号,根据标准曲线计算MMP-9浓度。
测定滑液样本的胶原酶活性。
将明胶-FITC固定于微孔板底部,加入样本孵育,胶原酶消化明胶释放荧光团,测量荧光信号的增强,根据标准曲线计算胶原酶含量。
评估明胶-FITC检测与抗体微阵列定量结果的相关性。
计算Pearson相关系数,检验明胶-FITC检测的胶原酶活性与MMP-9浓度的相关性。
按研究目的归类文中使用的方法,便于定位所需技术。
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 样本储存 | Eppendorf管 | Eppendorf | #40420050 |
| 抗体微阵列制作 | 玻璃显微镜载玻片 | LineaLAB | #1053057 |
| SIVG打印液 | IMG Pharma Biotech S.L. | 0.05% | |
| Nano_plotter | GeSiM mbH | NP 2.1 | |
| 抗体微阵列免疫检测 | 抗人MMP-9抗体 | Sino Biological | #10327-R043 |
| 十二烷基硫酸钠 | Sigma | #436143 | |
| MMP-9标准品 | Sino Biological | #10327-HNAH | |
| Alexa Fluor 647标记二抗 | Abcam | #ab150079 | |
| 抗体微阵列信号扫描 | Agilent G2565BA微阵列扫描仪 | Agilent Technologies | G2565BA |
| 数据分析 | ImageLab软件 | Bio-Rad | -- |
| 胶原酶活性检测 | 明胶-FITC偶联物 | BioVision | #M1303 |
| P386微孔板 | Greiner | #781289 | |
| 氯化钠 | -- | -- | |
| 氯化钙 | -- | -- | |
| Fluoroskan Ascent FL荧光酶标仪 | Thermo Fisher Scientific | #1506450 |
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 滑液样本收集与储存 | 样本来源、样本量(22例)、储存温度(-80°C)及伦理审批号。 阅读提示:Methods: Synovial fluid samples |
| 抗体微阵列制作与免疫检测 | 抗MMP-9抗体浓度(200 μg/mL)、打印液浓度(0.05% SIVG)、样本稀释比例(1:10 in 0.5% PBS-T and 0.01% SDS)、孵育条件(4°C过夜)、二抗浓度(5 μg/mL)、扫描波长(633 nm)。 阅读提示:Methods: Antibody microarray analysis of the samples |
| 明胶-FITC胶原酶活性检测 | 明胶-FITC浓度(19 μg/mL)、包被体积(50 μL/孔)、干燥条件(40°C过夜)、样本稀释(1:1)、孵育体积(50 μL/孔)、荧光读取参数(485/540 nm,37°C,20分钟,每2分钟一次)。 阅读提示:Methods: Collagenase activity of the samples |
| 统计分析 | 显著性水平(α=0.05)、双尾检验、相关分析方法(Pearson)。 阅读提示:Methods: Statistical analysis |