蛋白表达和纯化
获得高纯度和均一的SLC15A4、SLC15A4/TASL复合物及SLC15A4/ALFA纳米抗体复合物用于冷冻电镜研究。
在HEK293F细胞中表达带有Strep或FLAG标签的蛋白，经亲和纯化和凝胶过滤层析。
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人类内溶酶体TLR信号传导中SLC15A4招募TASL的结构基础
Structural basis for recruitment of TASL by SLC15A4 in human endolysosomal TLR signaling.
实验完整度
高包括冷冻电镜结构解析（三种状态）、细胞共定位和Co-IP验证相互作用、THP1敲除及回补功能实验、FRET验证二聚化、质谱鉴定糖基化和胆固醇。
主要模型
HEK293F细胞表达的重组人SLC15A4蛋白 HEK293T细胞共定位和Co-IP实验 THP1细胞系（TASL或SLC15A4敲除及回补）
重点核对
SLC15A4和TASL的共表达系统（HEK293F）及纯化条件（LMNG/CHS） TASL截短体（TASL(1-20)-EGFP）用于冷冻电镜结合EGFP刚性化策略 关键界面残基突变（如TASL E4K, Y6A；SLC15A4 E465K, R48A, K384A）对结合和功能的影响 R848刺激浓度（2μg/ml或5μg/ml）和刺激时间（24小时） THP1细胞敲除和回补实验中的sgRNA序列和载体（pLentiCRISPRv2）
摘要
Toll样受体（TLRs）是一类在识别病原体和启动先天免疫应答中起关键作用的蛋白质。TASL是最近发现的内溶酶体TLR7/8/9信号传导的先天免疫接头蛋白，由溶酶体质子偶联氨基酸转运体SLC15A4招募，随后激活IRF5，进而触发I型干扰素和细胞因子的转录。在此，我们报道了人SLC15A4在apo单体、二聚体以及TASL结合复合物中的三个冷冻电镜（cryo-EM）结构。apo形式呈外向构象，二聚体形式显示出涉及四个胆固醇分子的广泛界面。TASL结合复合物的结构揭示了溶质载体前所未有的相互作用模式。在招募TASL过程中，SLC15A4经历从外向、溶酶体腔暴露状态到内向状态的构象变化，形成结合口袋，允许TASL的N端螺旋插入。我们的发现为涉及人类溶质载体的调节开关的分子基础提供了见解，并为针对SLC15A4-TASL相关人类自身免疫性疾病的结构引导药物发现提供了重要框架。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- SLC15A4如何招募TASL以介导内溶酶体TLR信号传导？
- 核心机制
- SLC15A4从外向构象转变为内向构象，暴露出结合口袋，TASL的N端螺旋插入，形成1:1复合物。二聚体解聚伴随构象变化，TASL结合促进单体化。
- 主要证据
- 冷冻电镜结构（3.03Å、2.93Å和3.25Å）显示SLC15A4在apo二聚体（外向）和TASL结合态（内向）的构象差异；细胞共定位、Co-IP和功能实验验证界面残基的重要性；FRET实验支持体内二聚化。
- 研究意义
- 为理解SLC15A4介导的TASL招募机制提供结构基础，有助于靶向SLC15A4-TASL相关的自身免疫性疾病（如SLE）的药物发现。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
冷冻电镜结构解析
解析SLC15A4在apo单体、二聚体和TASL结合状态的结构，揭示构象变化。
制备冷冻电镜网格，用Titan Krios显微镜收集数据，用cryoSPARC进行单颗粒分析。
结合界面验证
通过细胞和生化实验验证SLC15A4-TASL相互作用的关键残基。
进行共定位、Co-IP和功能实验，检测TASL或SLC15A4突变对结合和信号传导的影响。
二聚化验证
验证apo SLC15A4在体内形成二聚体。
用FRET实验检测SLC15A4-GFP和SLC15A4-mCherry的相互作用。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 蛋白表达 | HEK293F细胞 | Thermo Fisher Scientific | R79007 |
| 细胞培养 | SMM 293-TII培养基 | Sino Biological | SMM |
| 青霉素-链霉素溶液 | Hyclone | SV30010 | |
| DMEM培养基 | -- | -- | |
| RPMI1640培养基 | -- | -- | |
| 蛋白纯化 | Strep-Tactin树脂 | IBA | 2-1208-500 |
| D-脱硫生物素 | IBA | 2-1000-005 | |
| LMNG/CHS预混溶液 | Anatrace | NG310-CH210 | |
| 抗FLAG亲和凝胶 | Sigma-Aldrich | A2220 | |
| 3xFLAG肽 | Sigma-Aldrich | F4799 | |
| 蛋白酶抑制剂混合物片剂 | Roche | 04693116001 | |
| Superose 6 5/150色谱柱 | GE Healthcare | -- | |
| 冷冻电镜 | Vitrobot Mark IV | FEI | -- |
| Titan Krios显微镜 | FEI | -- | |
| K3 summit直接电子探测器 | Gatan | -- | |
| cryoSPARC软件 | -- | -- | |
| 细胞染色 | Hoechst33342染料 | Thermo Fisher Scientific | H1399 |
| 抗体 | 抗Strep抗体 | Bioeasytech | BE2076 |
| 抗Flag抗体 | Bioeasytech | BE2004 | |
| 人CXorf21小鼠多克隆抗体 | Abcam | ab69152 | |
| 人SLC15A4兔多克隆抗体 | Abmar | PHC6279 | |
| ELISA | 人IL-8 ELISA试剂盒 | Sino Biological | KIT10098 |
| 人CCL2 ELISA试剂盒 | Invitrogen | 88-7399-88 | |
| 人TNFα ELISA试剂盒 | Invitrogen | 88-7346-88 | |
| IFNβ DuoSet试剂盒 | R&D | DY814-05 | |
| qPCR | ReliaPrep RNA细胞小提系统 | Promega | Z6011 |
| RevertAid第一链cDNA合成试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | K1622 | |
| KAPA SYBR FAST试剂盒 | Kapa Biosystems | KK4611 | |
| Western blot | PNGase F酶 | NEB | P0704L |
| PageRuler Plus预染蛋白梯 | Thermo Fisher Scientific | 26616 | |
| RIPA裂解缓冲液 | -- | -- | |
| 抗SAPK/JNK抗体 | Cell Signaling | 9252 | |
| 抗磷酸化SAPK/JNK抗体 | Cell Signaling | 4668 | |
| 抗IkBα抗体 | Cell Signaling | 4814 | |
| 抗磷酸化IkBα抗体 | Cell Signaling | 2859 | |
| 抗Flag M2抗体 | Sigma-Aldrich | F1804 | |
| 抗TASL (CXorf21)抗体 | Sigma-Aldrich | HPA001185 | |
| 抗IRF5抗体 | Abcam | ab181553 | |
| 抗GAPDH抗体 | Santa Cruz | sc-365062 | |
| 山羊抗兔IgG HRP | Jackson Immuno Research | 111-035-003 | |
| 山羊抗小鼠IgG HRP | Jackson Immuno Research | 115-035-003 | |
| 细胞刺激 | R848 | InvivoGen | tlrl-r848 |
| TL-8 | -- | -- | |
| 质谱分析 | Orbitrap Fusion质谱仪 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| Q-Exactive HFX轨道阱质谱仪 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| Byonic软件 | Protein Metrics | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 蛋白表达与纯化 | HEK293F细胞密度、转染DNA量和PEI比例、表达时间、增溶剂浓度 阅读提示：Methods: Protein expression and purification for cryo-EM analysis |
| 冷冻电镜样品制备 | 蛋白浓度、网格类型、blot时间、冷冻条件 阅读提示：Methods: Electron microscopy sample preparation and imaging |
| 结构解析 | 数据采集参数（放大倍数、像素大小、总剂量）、图像处理软件及流程 阅读提示：Methods: Image processing and 3D reconstruction |
| 细胞共定位和Co-IP | 质粒构建、转染试剂、细胞系、裂解缓冲液组成、抗体 阅读提示：Methods: Constructs and cellular fluorescence co-localization; Analyses of the SLC15A4-TASL interaction by immunoprecipitation |
| 功能实验 | THP1敲除细胞系构建（sgRNA序列）、回补表达、R848浓度和刺激时间、ELISA试剂盒、qPCR引物和条件 阅读提示：Methods: Genes knock out and rescue experiments; R848 treatment and enzyme-linked immunosorbent assay; R848 treatment and IFNB quantitative real-time PCR |