脂质库合成与筛选
鉴定具有高转染效率和免疫刺激活性的可生物降解可电离脂质。
通过Ugi三组分反应合成480种脂质，并对LNP进行分批体内筛选，评估mRNA转染效率和免疫激活。
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通过佐剂化可电离脂质和mRNA增强脂质纳米颗粒mRNA疫苗的免疫原性
Enhancing the immunogenicity of lipid-nanoparticle mRNA vaccines by adjuvanting the ionizable lipid and the mRNA
实验完整度
高包含脂质库合成与筛选、体外IRF报告细胞和BMDC激活、体内免疫原性评估（ELISpot、ELISA、流式细胞术）、小鼠肌内和鼻内免疫实验，以及C3d融合mRNA构建与验证等多层次功能与机制验证。
主要模型
C57BL/6J小鼠 THP1-Lucia ISG细胞 骨髓来源树突状细胞 HEK293T细胞
重点核对
LNP脂质组成及摩尔比（如331/DOPE/Chol/C14-PEG2000为35:16:46.5:2.5） mRNA剂量（如0.01μg、0.1μg、1μg） 免疫途径（肌内或鼻内）及时间表（第0天和第21天加强） 抗体内滴度检测方法（ELISA终点滴度定义）
摘要
为激发最佳免疫应答，信使RNA疫苗需要mRNA的胞内递送以及佐剂的审慎使用。在此，我们报道了一种多重佐剂化的mRNA疫苗，其包含封装mRNA编码抗原的脂质纳米颗粒，经过优化以实现高效的mRNA递送以及增强的先天和适应性应答的激活。我们通过筛选一个包含480种可生物降解的可电离脂质库（其头基用环胺佐剂化）以及通过将mRNA编码抗原与来源于C3补体蛋白的天然佐剂融合来佐剂化mRNA编码抗原，从而优化了疫苗。在小鼠中，通过肌内或鼻内给予含有先导可电离脂质以及编码融合蛋白（无论是刺突蛋白还是严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）的受体结合域）的mRNA的纳米颗粒，与编码未佐剂化抗原的疫苗相比，抗SARS-CoV-2抗体滴度增加了十倍。多重佐剂化的mRNA疫苗可能提高基于mRNA免疫的功效、安全性和给药便利性。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 如何通过佐剂化可电离脂质和mRNA双重策略增强脂质纳米颗粒mRNA疫苗的免疫原性？
- 核心机制
- 可电离脂质的环胺头基激活STING通路导致I型干扰素产生，增强适应性免疫；mRNA编码抗原与C3d融合，通过C3d-CD21相互作用增强B细胞刺激和抗原呈递。
- 主要证据
- 在小鼠模型中，脂质331 LNP诱导更强IRF激活和DC成熟；C3d融合mRNA疫苗诱导抗体滴度十倍升高，且与游离C3d混合无增强效果。
- 研究意义
- 多重佐剂化mRNA疫苗可能提高mRNA疫苗的功效、安全性和给药便利性，并支持鼻内给药。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
体外免疫刺激评估
评估顶级脂质LNP的免疫刺激能力。
用IRF报告细胞和BMDC检测IRF激活和成熟标志物表达，并与MC3和ALC-0315 LNP比较。
体内免疫原性评估
评估顶级脂质LNP在小鼠中的先天和适应性免疫反应。
检测淋巴结CXCL10表达、脾细胞IFN-γ ELISpot和OVA特异性IgG滴度。
C3d融合mRNA构建与验证
构建并验证C3d融合mRNA的抗原表达和LNP封装。
通过IVT合成mRNA，用cKK-E12 LNP封装，验证HEK293T细胞中蛋白表达和LNP特性。
C3d融合mRNA疫苗免疫原性研究
评估C3d融合mRNA疫苗在小鼠中的抗体和细胞免疫反应。
用cKK-E12 LNP封装mRNA进行免疫，检测血清抗体滴度、脾细胞ELISpot和B细胞表型。
脂质331与C3d融合的协同效应评估
评估脂质331和C3d融合双重佐剂策略在肌内和鼻内给药中的协同效应。
用MC3或脂质331 LNP封装RBDDelta或RBDDelta-C3d mRNA，通过肌内或鼻内免疫小鼠，检测抗体滴度和中和抗体。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | RPMI 1640培养基 | -- | -- |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| 粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子 | -- | -- | |
| LNP制备 | 1,2-二油酰基-3-三甲基铵丙烷 | Avanti | -- |
| 胆固醇 | Sigma-Aldrich | -- | |
| C14-PEG2000脂质 | Avanti | -- | |
| 十二烷基硫酸钠 | Sigma-Aldrich | -- | |
| mRNA合成 | HiScribe T7高产RNA合成试剂盒 | New England Biolabs | -- |
| 痘苗病毒加帽系统 | New England Biolabs | -- | |
| 大肠杆菌Poly(A)聚合酶 | New England Biolabs | -- | |
| Monarch RNA纯化试剂盒 | New England Biolabs | -- | |
| BsaI-HF v2 Golden Gate组装试剂盒 | New England Biolabs | -- | |
| EcoRI-HF限制性内切酶 | New England Biolabs | -- | |
| 假尿苷 | TriLink | -- | |
| 5-甲氧基尿苷修饰OVA mRNA | TriLink | -- | |
| LNP表征 | Zetasizer纳米粒度仪 | Malvern | -- |
| Quanti-iT Ribogreen RNA检测试剂盒 | Invitrogen | -- | |
| 6-(对甲苯胺基)-2-萘磺酸钠盐 | -- | -- | |
| 生物发光成像 | XenoLight D-荧光素 | PerkinElmer | -- |
| IVIS动力学成像系统 | PerkinElmer | -- | |
| Living Image软件 | PerkinElmer | 4.8.0 | |
| 体外转染 | ONE-Glo荧光素酶检测系统 | Promega | -- |
| Tecan Infinite M200 Pro酶标仪 | Tecan | -- | |
| 细胞培养 | RNeasy RNA提取试剂盒 | Qiagen | -- |
| RT-qPCR | SuperScript III第一链合成系统 | Invitrogen | -- |
| TaqMan基因表达检测 | Invitrogen | -- | |
| LightCycler 480实时荧光定量PCR仪 | Roche | -- | |
| CXCL10引物 | Invitrogen | Mm00445235_m1 | |
| Western blot | RIPA裂解液 | -- | -- |
| BCA蛋白定量试剂盒 | Thermo Scientific | 23227 | |
| 2x上样缓冲液 | Bio Rad | 1610738 | |
| 10x NuPage还原剂 | Invitrogen | NP0004 | |
| 4-12% Tris-甘氨酸凝胶 | Invitrogen | XP04122 | |
| 7.5% Tris-甘氨酸凝胶 | Bio-Rad | 5671025 | |
| 蛋白分子量标准 | Bio Rad | 1610377 | |
| 硝酸纤维素膜 | Invitrogen | IB21001 and IB23002 | |
| iBlot2转印仪 | Invitrogen | -- | |
| Licor Intercept TBS封闭液 | Licor | 927-60001 | |
| 抗β-肌动蛋白抗体 | Cell Signaling Technology | 3700S or 4970 | |
| 抗SARS-CoV-2刺突蛋白RBD抗体 | Sino Biological | 40592-T62 | |
| 抗SARS-CoV-2 S2抗体 | Sino Biological | 40590-T62 | |
| 抗C3d抗体 | R&D Systems | AF2655 | |
| 化学发光二抗 | Invitrogen | 31402 | |
| ELISA | SARS-CoV-2刺突蛋白检测ELISA试剂盒 | Sino Biological | KIT40591 |
| RBD检测ELISA试剂盒 | Sino Biological | KIT40592 | |
| TMB底物 | -- | -- | |
| HRP标记山羊抗小鼠IgG | Cell Signaling Technology | -- | |
| 96孔板 | Grenier | -- | |
| 免疫 | 异氟烷 | -- | -- |
| 中和试验 | TransIT-293转染试剂 | Mirus | mir2704 |
| Brightglo荧光素酶检测试剂 | Promega | E2610 | |
| ELISpot | 小鼠IFN-γ ELISpot试剂盒 | R&D Systems | -- |
| CTL ImmunoSpot S5 Versa ELISpot分析仪 | CTL | S5Versa-02-9038 | |
| 流式细胞术 | 可固定活力染料eFluor 450 | eBioscience | 65-0863-14 |
| 抗CD16/32抗体 | BioLegend | 101319 | |
| 抗CD3抗体 | BioLegend | 100221 | |
| 抗CD4抗体 | BioLegend | 100405 | |
| 抗CD8a抗体 | BioLegend | 100711 | |
| 抗CD44抗体 | BioLegend | 103007 | |
| 抗CD62L抗体 | BioLegend | 104431 | |
| 抗B220抗体 | BioLegend | 103211 | |
| 抗CD21/CD35抗体 | BioLegend | 123407 | |
| BD LSR II流式细胞仪 | BD | -- | |
| FlowJo软件 | -- | 10.4 | |
| 组织学 | 抗RFP抗体 | Abcam | ab62341 |
| Dylight 594山羊抗兔抗体 | Vector Labs | DI-1594 | |
| Alexa Fluor 647抗乙酰化微管蛋白抗体 | Santa Cruz | SC-23950 | |
| Alexa Fluor 488抗Uteroglobin/SCGB1A1/CC10抗体 | Santa Cruz | SC-390313 | |
| 肺解离试剂盒 | Miltenyi Biotec | -- | |
| 红细胞裂解液 | Qiagen | -- | |
| Zombie Aqua活力染料 | ThermoFisher | -- | |
| 抗CD45抗体 | BioLegend | 103134 | |
| 抗CD11c抗体 | BioLegend | 117313 | |
| Aperio数字病理切片扫描仪 | Leica | -- | |
| 细胞因子检测 | 多重小鼠细胞因子检测试剂盒 | Invitrogen | EPX360-26092-901 |
| 多重检测 | Magplex Luminex微球 | Luminex | -- |
| 硫代-NHS | Thermo Fisher | -- | |
| EDC | Thermo Fisher | -- | |
| PE偶联的山羊抗小鼠IgG | Southern Biotech | -- | |
| BirA500生物素化试剂盒 | Avidity | -- | |
| 链霉亲和素-PE | Agilent | -- | |
| iQue流式细胞仪 | Intellicyt | -- | |
| LC-MS | Agilent 6410三重四极杆质谱仪 | Agilent | -- |
| Acquity C8色谱柱 | Waters | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| LNP制备 | 脂质组成及摩尔比（如331/DOPE/Chol/C14-PEG2000=35:16:46.5:2.5），脂质与mRNA质量比 阅读提示：方法部分'LNP formulation' |
| mRNA合成 | mRNA修饰类型（假尿苷或5-甲氧基尿苷），加帽和加尾方法 阅读提示：方法部分'Plasmid and mRNA synthesis' |
| 细胞实验 | 细胞系（THP1-Lucia ISG, BMDC），刺激剂量和时长 阅读提示：方法部分'IRF-inducible reporter monocyte and BMDC activation assay' |
| 动物免疫 | 小鼠品系，给药途径（肌内/鼻内），mRNA剂量，免疫时间表（第0天和第21天） 阅读提示：方法部分'Mouse immunization'及图例3b |