CircNFATC3 promotes the proliferation of gastric cancer through binding to IGF2BP3 and restricting its ubiquitination to enhance CCND1 mRNA stability.
包含临床组织样本检测、体外细胞功能实验、体内动物模型验证以及分子机制研究（RIP、RNA pull-down、IP、泛素化实验），多个独立证据层级且包含功能验证和机制验证。
胃癌细胞系SGC7901、BGC823、HGC-27 BALB/c裸鼠皮下移植瘤模型 胃癌患者组织样本及组织芯片
胃癌细胞系SGC7901、BGC823用于体外功能与机制研究，HGC-27用于体内移植瘤模型。 circNFATC3敲低使用siRNA（si-circNFATC3-1和si-circNFATC3-2）及shRNA慢病毒（sh-circNFATC3）。 体内实验中，胆固醇修饰siRNA（5 nmol/kg）每2天肿瘤内注射一次，持续2-3周。 使用放线菌素D（5 μg/ml）处理0、3、6、9小时检测RNA稳定性。 使用CHX（20 µg/ml）处理0、6、12小时检测蛋白稳定性。
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
鉴定在胃癌细胞中与IGF2BP3蛋白结合的circRNAs，并筛选出在胃癌中异常表达的候选circRNA。
使用RIP-seq筛选胃癌SGC7901细胞中与IGF2BP3结合的circRNAs，并通过qRT-PCR在16对胃癌及癌旁组织中验证差异表达，选择circNFATC3进行后续研究。通过Sanger测序、RNase R处理、放线菌素D实验、核质分离和RNA-FISH鉴定circNFATC3的环状结构、稳定性和亚细胞定位。
验证circNFATC3与IGF2BP3蛋白在胃癌细胞中是否存在直接相互作用，并确定结合区域。
通过RIP实验检测IGF2BP3抗体富集的circNFATC3水平，通过RNA pull-down实验检测circNFATC3探针能否拉下IGF2BP3蛋白，通过RNA-FISH/IF实验观察二者的共定位，并通过构建IGF2BP3截短体进行RIP实验确定结合结构域。
确定circNFATC3在体外和体内对胃癌细胞增殖的功能影响。
使用siRNA或shRNA敲低circNFATC3后，通过CCK-8、平板克隆形成和EdU实验检测体外细胞增殖能力；在BALB/c裸鼠皮下接种HGC-27细胞构建移植瘤模型，通过肿瘤内注射胆固醇修饰siRNA敲低circNFATC3，评估肿瘤生长情况，并通过IHC检测Ki-67表达。
探究circNFATC3是如何调控IGF2BP3蛋白表达水平，特别是是否通过泛素-蛋白酶体途径影响蛋白稳定性。
检测circNFATC3敲低后IGF2BP3蛋白和mRNA水平；使用CHX追踪实验评估蛋白稳定性；使用蛋白酶体抑制剂MG132处理；通过IP检测IGF2BP3的泛素化水平；并检测TRIM25对IGF2BP3蛋白表达的调控及二者的相互作用，最后通过双敲除实验验证TRIM25在circNFATC3调控IGF2BP3中的作用。
验证circNFATC3对胃癌细胞增殖的促进作用是否依赖于IGF2BP3。
在circNFATC3敲低的细胞中过表达IGF2BP3，检测IGF2BP3蛋白水平变化以及细胞增殖能力的恢复情况。
寻找并验证circNFATC3-IGF2BP3轴调控的靶基因，特别是CCND1。
通过综合分析TCGA数据库上调基因、RIP-seq结合基因和IGF2BP3敲低后的下调基因，筛选候选靶基因。验证在IGF2BP3敲低、过表达或circNFATC3敲低后候选靶基因mRNA水平的变化，确定CCND1为靶基因。通过Western blot验证蛋白水平，通过RIP验证IGF2BP3与CCND1 mRNA的结合，通过放线菌素D实验检测CCND1 mRNA稳定性。
验证circNFATC3通过调控CCND1促进胃癌增殖，并确定这一功能在体内的必要性。
在circNFATC3敲低的细胞中过表达CCND1，检测细胞增殖能力的恢复。在裸鼠移植瘤模型中，联合注射胆固醇修饰siRNA和CCND1过表达慢病毒，评估肿瘤生长和增殖标志物表达。
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 临床样本收集与保存 | RNA保存液 | Thermo Scientific | -- |
| 细胞培养 | DMEM培养基 | -- | -- |
| RPMI 1640培养基 | Basal Media | -- | |
| 胎牛血清 | Lonsera | -- | |
| RNA稳定性分析 | RNase R | Lucigen | -- |
| RNA提取与qRT-PCR | RNAiso Plus | Takara | -- |
| PrimeScript RT Master Mix | Takara | -- | |
| SYBR Green Master Mix | Bioground | -- | |
| CFX connect实时荧光定量PCR系统 | BioRad | -- | |
| 核质分离 | Paris试剂盒 | Life Technologies | -- |
| RNA-FISH | RNA-FISH试剂盒 | GenePharma | -- |
| RNA-FISH/IF | IGF2BP3抗体 | Abcam | -- |
| 荧光二抗 | Signalway Antibody | -- | |
| 共聚焦显微镜 | Leica Microsystems | -- | |
| 组织芯片和原位杂交 | 原位杂交试剂盒 | Boster | -- |
| NBT/BCIP显色液 | Roche | -- | |
| 细胞转染 | Lipofectamine 2000转染试剂 | Invitrogen | -- |
| DNA转染试剂 | Neofect | -- | |
| pCDH质粒载体 | -- | -- | |
| pEGFP-N1载体 | Clontech | -- | |
| pCMV3-N-HA-TRIM25质粒 | Sino Biological | HG17528-NY | |
| pCMV-HA-Ub质粒 | -- | -- | |
| sh-circNFATC3慢病毒 | Hanbio | -- | |
| 嘌呤霉素 | -- | -- | |
| Western blot | RIPA裂解液 | Beyotime | -- |
| PMSF | Beyotime | -- | |
| 磷酸酶抑制剂 | Beyotime | -- | |
| PVDF膜 | -- | -- | |
| β-actin抗体 | Beyotime | -- | |
| IGF2BP3抗体 | Abcam | -- | |
| TRIM25抗体 | Abcam | -- | |
| CCND1抗体 | CUSabio | -- | |
| GFP抗体 | Roche | -- | |
| HA抗体 | Abmart | -- | |
| HRP标记的二抗 | Beyotime | -- | |
| ECL化学发光试剂 | BioScience | -- | |
| RIP | Magna RIP试剂盒 | Millipore | -- |
| RNA pull-down | RNA pull-down试剂盒 | -- | -- |
| 细胞增殖实验 | CCK-8试剂盒 | Biosharp | -- |
| Varioskan LUX酶标仪 | Thermo Scientific | -- | |
| Epson扫描仪 | Epson | -- | |
| EdU试剂盒 | Ribobio | -- | |
| 荧光倒置显微镜 | Olympus | -- | |
| 动物实验 | 胆固醇修饰siRNA | Genepharma | -- |
| 体内转染试剂 | Engreen | -- | |
| CCND1慢病毒 | Leqin Biotechnology | -- | |
| 免疫组织化学 | Ki-67抗体 | Servicebio | -- |
| IGF2BP3抗体 | Abcam | -- | |
| CCND1抗体 | CUSabio | -- | |
| 蛋白稳定性实验 | MG132 | MedChemExpress | -- |
| 免疫沉淀 | 免疫沉淀试剂盒 | Thermo Scientific | -- |
| RNA测序 | Trizol | Takara | -- |
| 统计分析 | Prism 8 | GraphPad | -- |
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 临床样本收集 | 样本类型：胃癌组织及癌旁组织；样本量：16对；保存条件：RNA Later，-80°C 阅读提示：见Methods中Clinical specimens部分 |
| 细胞培养 | 细胞系：SGC7901、BGC823（DMEM+10% FBS），HGC-27（RPMI 1640+10% FBS）；培养条件：37°C，5% CO2 阅读提示：见Methods中Cell lines部分 |
| circNFATC3敲低 | siRNA序列及转染试剂：si-circNFATC3-1和si-circNFATC3-2，Lipofectamine 2000或Neofect转染试剂；shRNA慢病毒敲低 阅读提示：见Methods中Cell transfections部分和Additional file 1: Table S6 |
| 体外增殖实验 | CCK-8：细胞数3×10^3/孔；克隆形成：1×10^3细胞/孔；EdU：3×10^4细胞/孔 阅读提示：见Methods中Cell proliferation assays部分 |
| RNA稳定性实验 | 放线菌素D浓度：5 μg/ml；处理时间：0、3、6、9 h 阅读提示：见Methods中Actinomycin D assay部分 |
| 蛋白稳定性实验 | CHX浓度：20 µg/ml；处理时间：0、6、12 h；MG132浓度：10 µM；处理时间：12 h 阅读提示：见Methods中Cycloheximide (CHX) and proteasome inhibitor (MG132) assays部分 |
| 动物实验 | 动物品系：雄性BALB/c裸鼠，3-4周龄；细胞接种：HGC-27细胞5×10^6皮下注射；siRNA给药：胆固醇修饰siRNA 5 nmol/kg，每2天一次，持续2-3周；CCND1慢病毒：每周一次，持续2周 阅读提示：见Methods中Animal experiments部分 |
