验证JG98对耐药细胞生长的抑制
确定JG98对恩杂鲁胺耐药前列腺癌细胞增殖的影响。
用不同浓度JG98处理C4-2B MDVR、CWR22Rv1细胞，并设IMR90和RWPE-1对照，计数细胞生存率；用JG98联合恩杂鲁胺处理细胞，计数细胞数；进行克隆形成实验。
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HSP70别构抑制与STUB1协同增强恩杂鲁胺在抗雄激素耐药前列腺肿瘤及患者来源模型中的疗效
Allosteric inhibition of HSP70 in collaboration with STUB1 augments enzalutamide efficacy in antiandrogen resistant prostate tumor and patient-derived models.
实验完整度
高体外细胞实验、患者来源CRC和类器官模型、体内异种移植瘤实验，包含功能验证和机制验证。
主要模型
C4-2B MDVR细胞 CWR22Rv1细胞 患者来源CRC和类器官 CWR22Rv1异种移植瘤模型
重点核对
JG98和JG231处理浓度 STUB1敲低后对AR-V7降解和细胞增殖的影响 JG231联合恩杂鲁胺在CWR22Rv1异种移植瘤中的肿瘤生长抑制 MG132对JG98诱导AR-V7降解的阻断作用
摘要
泛素蛋白酶体活性在恩杂鲁胺耐药的前列腺癌细胞中受到抑制，热休克蛋白70/STIP1同源性和U-box包含蛋白1（HSP70/STUB1）机制参与雄激素受体（AR）和AR变异体蛋白的稳定化。靶向HSP70可能是克服晚期前列腺癌雄激素受体信号抑制剂（ARSI）耐药的一种可行策略。在此，我们展示了一种新型HSP70别构抑制剂JG98，显著抑制耐药C4-2B MDVR和CWR22Rv1细胞生长，并增强恩杂鲁胺治疗。JG98还抑制了源自晚期前列腺癌患者样本的条件重编程细胞培养物（CRCs）和类器官的细胞生长。机制上，JG98降解耐药细胞中的AR/AR-V7表达，并促进STUB1核转位以结合AR-V7。敲低E3连接酶STUB1显著减弱了抗癌效果，并部分恢复了JG98对AR-V7的抑制作用。JG231是JG98开发出的更有效类似物，有效抑制耐药前列腺癌细胞、CRCs和类器官的生长。值得注意的是，JG231与恩杂鲁胺联合使用协同抑制AR/AR-V7表达，并抑制CWR22Rv1异种移植肿瘤生长。使用新型小分子抑制剂抑制HSP70与STUB1协同调节AR/AR-V7蛋白稳定性和ARSI耐药。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- HSP70别构抑制剂能否克服前列腺癌对恩杂鲁胺的耐药性，其机制是否涉及AR/AR-V7降解。
- 核心机制
- HSP70别构抑制剂通过STUB1介导AR/AR-V7的泛素-蛋白酶体降解，并抑制HSP70诱导的AR-V7转录活性。
- 主要证据
- JG98和JG231在C4-2B MDVR、CWR22Rv1细胞、患者来源CRC/类器官及异种移植瘤中抑制生长，并增强恩杂鲁胺疗效；机制上，STUB1敲低部分逆转JG98对AR-V7的降解。
- 研究意义
- 调节HSP70/STUB1可能成为治疗AR-V7过表达CRPC和改善恩杂鲁胺治疗的策略。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
验证JG98对AR/AR-V7表达的影响
检测JG98是否影响AR和AR-V7的蛋白表达及稳定性。
用不同浓度JG98处理耐药细胞，Western blot检测AR-V7、AR-FL和HSP70表达；免疫共沉淀检测AR-V7泛素化；用CHX追踪蛋白半衰期；用MG132处理检测蛋白酶体依赖性。
验证JG98通过STUB1促进AR-V7降解
探究STUB1在JG98诱导AR-V7降解中的作用。
在HEK293细胞中共表达AR-V7、HSP70和Flag-STUB1，用JG98处理后进行免疫荧光观察共定位；在C4-2B MDVR细胞中敲低STUB1，检测JG98对AR-V7表达和细胞增殖的影响。
转录组分析JG98调控的基因程序
探索JG98处理耐药细胞后影响的基因表达通路。
用JG98处理C4-2B MDVR细胞后进行RNA-seq和GSEA分析，鉴定差异表达基因和富集通路。
在患者来源CRC和类器官中评估JG98
验证JG98在临床相关模型中的功效。
从患者或PDX肿瘤建立CRC和类器官，用JG98单药或联合恩杂鲁胺处理，测定细胞活力和类器官死亡。
在体内模型中验证JG231联合恩杂鲁胺的疗效
评估JG231联合恩杂鲁胺对CWR22Rv1异种移植瘤的生长抑制作用。
将CWR22Rv1细胞皮下注射至SCID小鼠，等肿瘤体积达50-100mm³后随机分组，给予溶剂对照、恩杂鲁胺、JG231或联合治疗，测量肿瘤体积，并取肿瘤组织进行IHC检测。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | RPMI1640培养基 | -- | -- |
| DMEM培养基 | -- | -- | |
| 角质细胞无血清培养基 | Gibco | -- | |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| 药物处理 | 恩杂鲁胺 | Selleck Chemical | -- |
| 阿帕他胺 | Selleck Chemical | -- | |
| 达罗他胺 | Selleck Chemical | -- | |
| 醋酸阿比特龙 | Selleck Chemical | -- | |
| JG98 | -- | -- | |
| JG231 | -- | -- | |
| 细胞转染 | Lipofectamine-iMAX转染试剂 | Invitrogen | -- |
| Lipofectamine 2000转染试剂 | Invitrogen | -- | |
| Western blot | AR (441)抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-7305 |
| 泛素抗体 | Santa Cruz Biotechnology | -- | |
| STUB1抗体 | Cell Signaling Technology | 2080 | |
| AR-V7抗体 | Precision antibody | AG10008 | |
| FLAG® M2抗体 | Sigma-Aldrich | F1804 | |
| c-Myc抗体 | Cell Signaling Technology | 18583 | |
| HSP70抗体 | Cell Signaling Technology | 4873 | |
| 微管蛋白抗体 | Sigma-Aldrich | T5168 | |
| 肌动蛋白抗体 | Cell Signaling Technology | 4970 | |
| GAPDH抗体 | Cell Signaling Technology | 2118 | |
| 二抗 | Promega | W4021 | |
| 免疫共沉淀 | 蛋白A/G琼脂糖 | -- | -- |
| 免疫荧光 | BZ-X700荧光显微镜 | Keyence | -- |
| RT-qPCR | RNeasy迷你试剂盒 | Qiagen | -- |
| SsoFast Eva Green超混合液 | Bio-Rad | -- | |
| RQ1脱氧核糖核酸酶 | Promega | -- | |
| 荧光素酶检测 | 荧光素酶检测系统 | Promega | -- |
| 细胞活力检测 | 细胞计数试剂盒-8 | -- | -- |
| RNA-seq | Illumina Tru-Seq RNA样本制备试剂盒 | Illumina | -- |
| HiSeq 4000测序仪 | Illumina | -- | |
| 类器官培养 | IV型胶原酶 | STEMCELL | -- |
| Advanced DMEM培养基 | Gibco | -- | |
| GlutaMAX添加剂 | Gibco | -- | |
| B27添加剂 | Gibco | -- | |
| N-乙酰半胱氨酸 | Thermo Scientific | -- | |
| 人重组表皮生长因子 | Thermo Scientific | -- | |
| 重组成纤维细胞生长因子10 | Invitrogen | -- | |
| A-83-01 | Tocris | -- | |
| SB202190 | Bioscience | -- | |
| 烟酰胺 | Thermo Scientific | -- | |
| 二氢睾酮 | Sigma | -- | |
| 前列腺素E2 | Bioscience | -- | |
| Noggin蛋白 | Thermo Scientific | -- | |
| R-spondin蛋白 | R&D Systems | -- | |
| Matrigel基质胶 | -- | -- | |
| 类器官活力检测 | CellTiter-Glo发光法细胞活力检测试剂盒 | Promega | -- |
| LIVE/DEAD®活力/细胞毒性检测试剂盒 | Thermo Scientific | -- | |
| 动物实验 | NSG小鼠 | Envigo | -- |
| SCID小鼠 | Envigo | -- | |
| 免疫组化 | Ki67抗体 | Neomarker | -- |
| Vectastain ABC Elite试剂盒 | Vector Laboratories | -- | |
| DAB显色试剂盒 | Vector Laboratories | -- | |
| Olympus BX51显微镜 | Olympus | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养 | C4-2B MDVR细胞需在含20μM恩杂鲁胺的培养基中维持；CWR22Rv1、C4-2B MDVR使用RPMI1640，HEK293和IMR90使用DMEM，RWPE-1使用角质细胞无血清培养基；所有细胞在37°C、5% CO2培养。 阅读提示：Methods 2.1 |
| 细胞活力检测 | JG98处理浓度范围、处理时间（3或5天）、细胞密度、组合处理时恩杂鲁胺浓度。 阅读提示：Results 4.1, Methods 2.8 |
| 克隆形成实验 | 细胞接种密度（C4-2B MDVR 400细胞/孔，UCD1172CR 5000细胞/孔）、JG98浓度、恩杂鲁胺浓度（20μM）、培养时间3周。 阅读提示：Methods 2.9 |
| Western blot | 抗体稀释比例（AR 1:1000, AR-V7 1:1000等）、裂解液成分、处理时间。 阅读提示：Methods 2.3 |
| 免疫共沉淀 | 抗体用量（1μg）、细胞裂解液量（1500μg）、洗涤缓冲液成分。 阅读提示：Methods 2.4 |
| 免疫荧光 | 细胞密度（1×10^4）、转染时间（3天）、JG98和MG132处理浓度和时间（5μM MG132, 16h）。 阅读提示：Methods 2.5 |
| RT-qPCR | RNA提取试剂盒、引物序列（Table S1）、内参基因（actin）。 阅读提示：Methods 2.6 |
| 荧光素酶报告基因 | DHT浓度（1mM）、JG98浓度（2.5, 5μM）、恩杂鲁胺浓度、转染质粒。 阅读提示：Methods 2.7 |
| RNA-seq | 细胞处理浓度（2.5, 5μM JG98）、处理时间（24h）、测序平台（HiSeq 4000）、数据分析流程。 阅读提示：Methods 2.10 |
| 类器官培养 | 肿瘤消化时间（30min）、基质胶比例（1:3）、培养基添加剂种类、处理时间（7天）、活力检测方法。 阅读提示：Methods 2.12 |
| 动物实验 | 细胞接种数量（4×10^6）、小鼠周龄（4-5周）、分组和处理方案（恩杂鲁胺25mg/kg p.o. 每日，JG231 4mg/kg i.p. 隔日，治疗18天）。 阅读提示：Methods 2.13 |