构建Tet-on Hmgn3过表达载体
构建可用于DOX诱导的Hmgn3过表达载体，以便在ESCs中实现可控的Hmgn3表达。
从WT-TSCs cDNA中扩增Hmgn3-CDS（321 bp），克隆至PB-TRE-Puror载体，通过菌落PCR和Sanger测序验证，并提取无内毒素的质粒。
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从小鼠胚胎干细胞生成诱导滋养层干细胞的操作规程
Protocol to generate induced trophoblast stem cells from embryonic stem cells in mice.
实验完整度
中包含载体构建、细胞诱导、CDCP1分选、免疫荧光、分化及体内移植等步骤，但缺少具体定量结果和重复数，未涉及机制探讨。
主要模型
小鼠胚胎干细胞（ESC，129Sv/Jae背景） 诱导滋养层干细胞（iTSC） 野生型滋养层干细胞（TSC）
重点核对
诱导Hmgn3过表达使用DOX浓度1 μg/mL，筛选使用嘌呤霉素浓度1 μg/mL 构建Tet-on Hmgn3-OE载体时：模板为WT-TSCs cDNA，扩增片段为Hmgn3-CDS 321 bp 电穿孔条件：Neon系统，1400 V，10 ms，3次脉冲 iTSCs诱导时：使用TSC基础培养基（无FGF4），细胞起始密度为5 × 10^4/35 mm皿，培养21天
摘要
摘要：在小鼠中，从内细胞团来源的胚胎干细胞（ESCs）转化为滋养外胚层（TE）来源的滋养层干细胞（TSCs）在自然界中难以实现。在此，我们介绍了一种可靠且可重复的操作规程，通过体外Tet-on系统从ESCs生成诱导型TSCs（iTSCs）。iTSCs表现出典型的TSC特性，并具有分化为合体滋养层细胞（STCs）和滋养层巨细胞（TGCs）的潜力。这种细胞命运转换提供了一个通用平台，以有力地研究TE特化的机制。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 如何通过过表达Hmgn3在体外将小鼠ESCs转化为iTSCs，并验证iTSCs的特性及其分化能力。
- 核心机制
- Hmgn3过表达在DOX诱导下促进ESCs向TSC命运转变，但具体机制需进一步研究。
- 主要证据
- 通过构建Tet-on Hmgn3-OE系统，在DOX处理后，Hmgn3-OE ESCs可形成典型TSC样克隆；免疫荧光检测到TSC标记CDX2、EOMES和TFAP2C；随机分化后检测到STC标记TPBPA、STB标记SDC1和TGC标记GCM1；体内移植形成出血性病变并表达相关标记。
- 研究意义
- 该规程提供了一个通用平台，用于研究TE特化的机制，并可验证候选基因在ESC向TSC转变中的作用。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
建立可诱导的Hmgn3过表达ESC细胞系
将Tet-on Hmgn3-OE载体导入ESCs，获得稳定响应DOX的Hmgn3过表达细胞系。
通过电穿孔将Tet-on Hmgn3-OE质粒、PB-rtTA-Hygr质粒和PBase质粒共转染ESCs，经DOX和嘌呤霉素筛选，并通过qPCR和基因分型验证。
诱导iTSCs并富集CDCP1阳性细胞
通过Hmgn3过表达将ESCs诱导为TSC样细胞，并纯化。
将Hmgn3-OE ESCs在TSC基础培养基中培养21天，然后通过CDCP1抗体染色和细胞分选富集CDCP1阳性细胞，继续培养。
鉴定iTSCs特性
确认诱导的iTSCs具有TSC典型标记和分化潜能。
通过免疫荧光检测TSC标记（CDX2、EOMES、TFAP2C），通过随机分化检测STC、STB和TGC标记（TPBPA、SDC1、GCM1），通过PI染色进行DNA含量分析，并通过体内移植形成畸胎瘤检测。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 载体构建 | Phanta® Max超高保真DNA聚合酶试剂盒 | Vazyme | P505-d1 |
| SanPrep柱式DNA凝胶回收试剂盒 | Sangon Biotech | B518131 | |
| SanPrep柱式PCR产物纯化试剂盒 | Sangon Biotech | B518141 | |
| Trans1-T1噬菌体抗性化学感受态细胞 | Transgen | CD501-02 | |
| GoldHi无内毒素质粒大提试剂盒 | CWBIO | CW2104 | |
| 细胞转染 | Neon™转染系统试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | MPK10096 |
| Neon™转染系统 | Thermo Fisher | MPK5000 | |
| 细胞培养 | 多西环素 | MCE | HY-N0565B |
| 嘌呤霉素 | Thermo Fisher | A1113803 | |
| PD0325901 | MCE | HY-10254 | |
| CHIR-99021 | MCE | HY-10182 | |
| 小鼠重组LIF蛋白 | Sino Biological | 50756-MNAH | |
| 重组人FGF-4 | Peprotech | 100-31 | |
| 肝素 | Millipore | 375095 | |
| 纤连蛋白 | Millipore | ECM001 | |
| Y27632 | MCE | HY-10071 | |
| 明胶 | Sigma-Aldrich | V900863 | |
| DMEM/F-12培养基 | Thermo Fisher Scientific | 11320033 | |
| DMEM培养基 | Thermo Fisher Scientific | 12800017 | |
| RPMI 1640培养基，含GlutaMAX™补充剂 | Thermo Fisher Scientific | 61870036 | |
| GlutaMAX™补充剂 | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | |
| MEM非必需氨基酸溶液（100×）（NEAA） | Thermo Fisher Scientific | 11140050 | |
| 青霉素-链霉素 | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| 0.05%胰蛋白酶-EDTA，含酚红 | Thermo Fisher Scientific | 25300062 | |
| 0.25%胰蛋白酶-EDTA，含酚红 | Thermo Fisher Scientific | 25300072 | |
| 磷酸盐缓冲液（PBS） | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| 二甲基亚砜（DMSO） | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| 牛血清白蛋白 | Sigma-Aldrich | A1933 | |
| 胎牛血清（FBS） | Biological Industries | 04-002-1A | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| 基因表达分析 | TRIzol试剂 | Thermo Fisher | 15596018 |
| Hifair第一链cDNA合成SuperMix（用于PCR） | Yeasen | 11141ES60 | |
| qPCR SYBR Green预混液（无ROX） | Yeasen | H0001451 | |
| NanoDrop分光光度计 | Thermo Fisher | M020 | |
| 实时荧光定量PCR检测系统 | Bio-Rad | CFX96 | |
| 流式分析 | 研究用细胞分选仪 | Beckman Coulter | MoFlo |
| 研究用流式细胞分析仪 | BD | BD | |
| 免疫荧光 | 共聚焦显微镜 | Leica | TCS |
| 细胞培养与计数 | LUNA-II™全自动细胞计数仪 | LUNA | LUNA-II |
| 细胞培养 | 康宁组织培养处理培养皿 | Corning | CLS430165 |
| Costar组织培养板，6孔 | Corning | 3516 | |
| Costar组织培养板，24孔 | Corning | 3524 | |
| 100 mm组织培养皿 | Corning | 430167 | |
| 0.22 μm无菌注射器过滤器 | Millipore | SLGP033RK | |
| 流式分选 | 40 μm细胞筛网 | BD | 352340 |
| 细胞培养 | 1.5 mL微量离心管 | Axygen | MCT-150-C |
| 免疫荧光 | 圆形盖玻片 | Electron Microscopy Sciences | 72196-12 |
| 载体构建 | 200 μL PCR管 | NEST | 401001 |
| 细胞培养 | 无菌15 mL管 | Corning | 430790 |
| 无菌50 mL管 | Corning | 430828 | |
| 流式分选 | 5 mL BD管 | BD | 352063 |
| 免疫荧光 | 抗EOMES抗体 | Abcam | ab23345 |
| 抗CDX2抗体 | Abcam | ab76541 | |
| 抗TPBPA抗体 | Abcam | ab104401 | |
| 抗TFAP2C抗体 | Santa Cruz | sc-12762 | |
| 流式分选 | 抗CDCP1抗体 | R&D Systems | AF4515 |
| 免疫荧光 | 抗GCM1抗体 | Santa Cruz | sc-101173 |
| 抗SDC1抗体 | Abclonal | A4174 | |
| 免疫组化 | 抗CD31抗体 | Santa Cruz | sc-376764 |
| 免疫荧光 | FITC羊抗小鼠IgG (H+L) | Abclonal | AS001 |
| FITC羊抗兔IgG (H+L) | Abclonal | AS011 | |
| Alexa Fluor 488驴抗绵羊IgG (H+L) | Yeason | 34906ES60 | |
| Hoechst 33342染料 | Thermo Fisher Scientific | H3570 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 载体构建 | PCR扩增Hmgn3-CDS的退火温度、延伸时间、循环数；限制性内切酶BamHI和MluI的限制性酶切反应体系；连接反应条件及感受态细胞转化条件 阅读提示：见Before you begin第3-7步（载体构建）及表S1引物序列 |
| 细胞转染 | 电穿孔参数：1400 V、10 ms、3脉冲；质粒DNA用量（Tet-on Hmgn3-OE质粒3 μg，PB-rtTA-Hygr质粒3 μg，PBase质粒1 μg）；转染后细胞培养条件 阅读提示：见Before you begin第21-26步（转染Hmgn3过表达载体到ESCs） |
| 药物筛选 | DOX浓度（1 μg/mL），嘌呤霉素浓度（1 μg/mL）（原文未明确给药时间，步骤27写明加DOX 2-3天后开始加嘌呤霉素，每天换液，筛选两天） 阅读提示：见Before you begin第27步 |
| iTSCs诱导 | 起始细胞密度（5 × 10^4/35 mm皿），培养时间（21天），培养基（TSC基础培养基，无FGF4），DOX浓度（1 μg/mL） 阅读提示：见Step-by-step method details第1-5步 |
| CDCP1阳性细胞分选 | 抗体孵育时间（30分钟），抗体用量（40 μL/百万细胞），分选后培养条件（TSC培养基，2 × 10^5细胞/24孔板），是否添加Y27632（10 μM可选） 阅读提示：见Step-by-step method details第6-14步 |
| iTSCs鉴定 | 免疫荧光固定液浓度（4% PFA）、固定时间（15分钟）、封闭液（2% BSA + 0.1% Triton X-100）及时间（2小时），一抗稀释度（见Key resources table），Hoechst浓度（5 μg/mL） 阅读提示：见Step-by-step method details第15步及Figure 4图注 |
| 随机分化 | 分化培养基（TSC differentiation medium），分化时间（6天），DNA含量分析中PI浓度（50 μg/mL）及染色时间（20分钟，37°C） 阅读提示：见Step-by-step method details第16-17步 |
| 体内分化 | 细胞注射数量（1 × 10^7），注射部位（SCID小鼠肢体），观察时间（21天），固定条件（4% PFA过夜） 阅读提示：见Step-by-step method details第18步 |