细胞刺激与S100A15表达检测
验证LPS、LTA及热灭活细菌能否诱导GF和KB细胞表达S100A15。
用LPS(100 ng/mL)、LTA(50 ng/mL)或热灭活P. gingivalis和S. sanguinis(2×10^4 cells/mL)刺激GF和KB细胞，不同时间点收样，提取RNA，进行RT-PCR和qRT-PCR检测S100A15 mRNA，并用ELISA检测蛋白。
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口腔微生物病原体诱导抗菌蛋白S100A15表达依赖于Toll样受体激活c-Jun N端激酶(JNK)、p38和NF-κB通路
Induction of Antimicrobial Protein S100A15 Expression by Oral Microbial Pathogens Is Toll-like Receptors-Dependent Activation of c-Jun-N-Terminal Kinase (JNK), p38, and NF-κB Pathways.
实验完整度
高包含细胞系刺激实验、TLR中和抗体实验、激酶通路抑制剂实验、临床牙龈组织免疫组化和唾液PCR检测，多层次功能与机制验证。
主要模型
人牙龈成纤维细胞(GF) 人口腔表皮样癌细胞(KB) 炎症牙龈患者组织样本
重点核对
细胞系：GF和KB细胞系 刺激物及浓度：LPS(100 ng/mL)、LTA(50 ng/mL)、热灭活P. gingivalis和S. sanguinis(2×10^4 cells/mL) 刺激时间：48小时 抑制剂处理：SP600125、SB-203580、Bay11-7082、硫氧还蛋白预处理1小时 TLR中和抗体：抗TLR2、抗TLR4抗体预处理
摘要
抗菌蛋白S100A15属于S100家族，该家族在多种正常和病理组织中差异表达。尽管已有研究探讨了S100A15蛋白的功能，但其在口腔黏膜中的诱导和调控机制至今在很大程度上未知。在本研究中，我们证明S100A15可被革兰氏阴性或革兰氏阳性细菌病原体以及纯化的膜成分，即脂多糖(LPS)和脂磷壁酸(LTA)刺激口腔黏膜所诱导。用人牙龈成纤维细胞(GF)和人口腔表皮样癌(KB)细胞系刺激革兰氏阴性或革兰氏阳性细菌病原体或其纯化的膜成分(LPS和LTA)，会导致NF-κB、凋亡信号调节激酶1(ASK1)和MAP激酶信号通路(包括c-Jun N端激酶(JNK)和p38)及其生理底物AP-1和ATF-2的激活。通过抗体介导的Toll样受体4(TLR4)或Toll样受体2(TLR2)中和抑制S100A15，揭示LPS/革兰氏阴性细菌病原体诱导的S100A15蛋白表达是TLR4依赖性机制，而LTA/革兰氏阳性细菌病原体诱导的表达是TLR2依赖性机制。用JNK(SP600125)、p38(SB-203580)或NF-κB(Bay11-7082)特异性抑制剂预处理GF和KB细胞，进一步证明了JNK、p38和NF-κB通路在调控革兰氏阴性/革兰氏阳性细菌病原体诱导的S100A15表达中的重要性。我们的数据提供了S100A15在癌症和非癌症口腔黏膜来源细胞系中被革兰氏阴性/革兰氏阳性细菌病原体诱导的证据，并揭示了革兰氏阴性和革兰氏阳性细菌病原体在口腔黏膜中诱导S100A15表达的分子机制。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 口腔黏膜中抗菌蛋白S100A15是否由革兰氏阴性和革兰氏阳性细菌病原体诱导，以及其分子调控机制是什么？
- 核心机制
- 革兰氏阴性菌通过TLR4、革兰氏阳性菌通过TLR2，经TRAF6激活NF-κB、ASK1-JNK-AP-1和ASK1-p38-ATF-2三条通路，协同调控S100A15的转录表达。
- 主要证据
- GF和KB细胞中LPS/LTA及热灭活菌刺激诱导S100A15表达，TLR中和抗体和通路抑制剂实验证实TLR依赖及三条通路参与，临床炎症牙龈组织免疫组化阳性及唾液PCR检出病原菌。
- 研究意义
- 揭示了口腔黏膜先天免疫中抗菌蛋白S100A15的诱导机制，可能有助于口腔黏膜抵御口腔微生物病原体。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
TLR受体中和实验
确定S100A15诱导是否依赖TLR4或TLR2。
GF和KB细胞先用抗TLR2、抗TLR4或对照IgG预处理，再刺激以热灭活菌或LPS/LTA，48小时后提取RNA，qRT-PCR检测S100A15表达。
信号通路激活检测
验证细菌刺激是否激活TRAF6、ASK1、JNK、p38、NF-κB及其下游转录因子。
GF和KB细胞经细菌刺激48小时后，制备总蛋白和核提取物，用Western blot检测TRAF6表达和ASK1、JNK、p38磷酸化，用EMSA检测转录因子AP-1、ATF-2、NF-κB的DNA结合活性，用激酶实验检测IKK活性及IκBα降解。
通路抑制剂验证
验证ASK1-JNK、ASK1-p38和NF-κB通路在S100A15诱导中的必要性。
GF和KB细胞分别用ASK1抑制剂(硫氧还蛋白)、JNK抑制剂SP600125、p38抑制剂SB-203580、NF-κB抑制剂Bay11-7082单独或联合预处理，再刺激细菌，检测S100A15表达及信号通路变化。
临床样本验证
验证S100A15在炎症牙龈中的表达及病原菌的存在。
收集健康个体和炎症牙龈患者的牙龈组织活检，进行免疫组化检测S100A15；收集患者唾液，用PCR检测P. gingivalis和S. sanguinis的特异性基因片段。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | -- | -- |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| 细菌培养 | LB培养基 | -- | -- |
| 刺激处理 | 脂多糖 | Sigma-Aldrich | -- |
| RNA提取 | RNA提取试剂盒 | Qiagen | -- |
| RT-PCR | High-Capacity RNA-to-cDNA™ 试剂盒 | Applied Biosystems™ | 4387406 |
| qRT-PCR | SYBR Green 预混液 | Applied Bioscience | 4385616 |
| Western blot | 抗ASK1抗体 | Santa Cruz Biotechnology | SC-7931 |
| 抗JNK抗体 | Santa Cruz Biotechnology | Sc-474 | |
| 抗p38抗体 | Santa Cruz Biotechnology | Sc-535 | |
| 抗肌动蛋白抗体 | Santa Cruz Biotechnology | SC-1615 | |
| 抗TRAF6抗体 | Abcam | ab33915 | |
| 抗S100A15抗体 | Sino Biological | 50226-RP01 | |
| ELISA | S100A15 ELISA试剂盒 | BioMatik corporation | EKN48277 |
| EMSA | T4多核苷酸激酶 | Genecraft | -- |
| [γ-32P] dATP | Hartmann Analytika | -- | |
| 激酶实验 | GST-IκBα(1-317)蛋白 | Santa Cruz | SC-4094 |
| 抗IKKα(C-6)抗体 | Santa Cruz | SC-166231 | |
| 免疫组化 | S100A15抗体 | -- | -- |
| 酶修复仪 | Biogenex | -- | |
| 正常猪血清 | Dako A/S | lot | |
| Leica DMRB光学显微镜 | Leica | -- | |
| PCR | Taq DNA聚合酶 | Genecraft | -- |
| 1-kb DNA分子量标准 | Genecraft | -- | |
| 热循环仪 | BioRad | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞刺激 | 细胞系：GF和KB细胞；刺激物及浓度：LPS 100 ng/mL、LTA 50 ng/mL、热灭活P. gingivalis和S. sanguinis 2×10^4 cells/mL；刺激时间：48小时 阅读提示：见图1和图2及4.1节 |
| TLR中和实验 | 抗TLR2、抗TLR4抗体浓度及预处理时间（1小时）；细胞刺激时间（48小时） 阅读提示：见图2及补充材料图S2 |
| 信号通路检测 | 细胞刺激时间（48小时）；抗体稀释度；核提取物用量 阅读提示：见图3、图4、图5及4.3、4.4、4.6、4.7节 |
| 抑制剂实验 | 抑制剂种类及浓度（SP600125、SB-203580、Bay11-7082、硫氧还蛋白）；预处理时间（1小时）；刺激时间（48小时） 阅读提示：见图6及补充材料图S3、S4 |
| 临床样本 | 样本量（健康n=3、炎症牙龈n=3）；组织处理；免疫组化抗体浓度；PCR引物及条件 阅读提示：见图7及4.8、4.9、4.10节 |