过氧化物库的筛选
筛选能够结合SARS-CoV-2 RBD的过氧化物化合物。
使用生物层干涉法（BLI）对52种过氧化物化合物进行高通量筛选，以RBD蛋白为靶标，以PBS为阴性对照、EGCG为阳性对照，检测化合物与RBD的结合。
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过氧化物衍生物作为SARS-CoV-2进入抑制剂
Peroxide derivatives as SARS-CoV-2 entry inhibitors.
实验完整度
高包含BLI筛选、ELISA、免疫荧光、假病毒中和、真实病毒中和、空斑减少、TCID50及细胞毒性等多层级验证，并进行了体内外功能与机制验证。
主要模型
HEK293T-hACE2/mCherry细胞 Vero E6细胞 SARS-CoV-2 Delta变异株 SARS-CoV-2 Omicron BA.1变异株
重点核对
化合物21和29在不同RBD变异株（delta plus、lambda、gamma、omicron）上的结合亲和力 化合物21和29对RBD-ACE2结合的抑制浓度（25-200 μM） 假病毒中和实验中的EC50 真实SARS-CoV-2感染实验中的CPE抑制和空斑减少 TCID50测定病毒载量减少
摘要
严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）是正在进行的2019冠状病毒病（COVID-19）大流行的原因。宿主细胞入侵是由病毒刺突蛋白（S）通过受体结合域（RBD）与人血管紧张素转换酶2（ACE2）的相互作用介导的。在这项工作中，使用生物层干涉法（BLI）筛选了一系列52种过氧化物，包括氨基过氧化物和桥连1,2,4-三氧杂环戊烷（臭氧化物），旨在鉴定干扰RBD-ACE2相互作用的小分子。我们发现两种化合物，化合物21和29，表现出抑制RBD-ACE2的活性。它们进一步被证明可抑制SARS-CoV-2进入细胞，如假病毒实验和真实SARS-CoV-2实验所示。进行了全面的计算机模拟分析以研究理化性质和药代动力学性质，揭示这两种化合物均具有良好的理化性质以及良好的生物利用度。我们的结果突出了靶向RBD抑制剂的小分子作为COVID-19潜在治疗药物的潜力。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 过氧化物衍生物能否作为SARS-CoV-2进入抑制剂，通过靶向刺突蛋白受体结合域（RBD）阻断病毒进入？
- 核心机制
- 化合物21和29通过结合SARS-CoV-2刺突蛋白的RBD，抑制RBD与ACE2的相互作用，从而阻断病毒进入宿主细胞。
- 主要证据
- BLI筛选显示化合物21和29与RBD结合；ELISA和免疫荧光证实其抑制RBD-ACE2结合；假病毒和真实病毒实验显示其抑制Delta变异株感染，但对Omicron BA.1效果减弱；计算机模拟预测表明化合物具有良好理化性质。
- 研究意义
- 研究结果表明小分子靶向RBD抑制剂作为COVID-19治疗药物具有潜力，为设计有效的SARS-CoV-2进入抑制剂提供基础。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
RBD结合活性验证
验证筛选出的化合物（4, 21, 29）与RBD的结合亲和力。
对初筛得到的化合物进行BLI结合动力学实验，测量与不同RBD变异株（delta plus、lambda、gamma、omicron）的解离常数（KD）。
细胞毒性评估
评估活性化合物的细胞毒性，排除毒性大的候选物。
在HEK293T-hACE2/mCherry和Vero E6细胞上，用MTT法测定化合物处理48小时后的细胞活力，计算IC50。
RBD-ACE2结合抑制实验
检测化合物是否能阻断RBD与ACE2的结合。
使用ELISA试剂盒（BPS Biosciences）检测化合物对野生型RBD与ACE2结合的抑制作用；并使用免疫荧光染色检测化合物对delta plus和omicron RBD与细胞表面ACE2结合的影响。
假病毒中和实验
评估化合物抑制SARS-CoV-2假病毒进入宿主细胞的能力。
包装表达delta或omicron刺突蛋白的假病毒，在HEK293T-hACE2细胞上测定化合物对假病毒进入的抑制作用。
真实病毒中和实验
在BSL-3条件下评估化合物对真实SARS-CoV-2感染和复制的抑制效果。
在Vero E6细胞上，用delta和omicron BA.1病毒株感染，化合物处理后观察细胞病变效应（CPE），进行空斑减少和TCID50实验。
计算机模拟性质预测
预测化合物的理化性质和药代动力学特性，评估其药物潜力。
使用Data Warrior、BOILED-Egg、SwissADME和ProTox等软件预测化合物的分子性质、血脑屏障渗透、GI吸收、CYP抑制作用及毒性。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 分子生物学 | pHDM-Hgpm2 | Addgene | #164441 |
| pHDM-Tat1b | Addgene | #164442 | |
| pRC-CMV-Rev1b | Addgene | #164443 | |
| pMD2.G | Addgene | #12259 | |
| Omicron变异株刺突质粒 | Genscript | MC_0101274 | |
| In-Fusion重组反应 | Takara | #638947 | |
| 结合实验 | 重组RBD蛋白 | Sino Biological | 40592-V08H115; 40592-V08H113; 40592-V08H86; 40592-V08H121 |
| 细胞培养 | HEK293T细胞 | ATCC | CRL-3216 |
| HEK293T细胞 | BeNa Culture Collection | BNCC353535 | |
| Vero E6细胞 | ATCC | -- | |
| 青霉素-链霉素-谷氨酰胺 | Gibco | 10378016 | |
| ELISA | ACE2 SARS-CoV-2刺突抑制剂筛选试剂盒 | BPS Biosciences | Cat: 79936 |
| 免疫荧光 | Lipofectamine 3000 | Invitrogen | L3000150 |
| Alexa Fluor 647偶联的抗His抗体 | Cell Signaling Technology | 14931S | |
| 显微镜成像 | 徕卡TCS SP8激光扫描共聚焦显微镜 | Leica | -- |
| 细胞培养 | MTT | -- | -- |
| SDS | -- | -- | |
| 数据拟合 | Graphpad Prism 8.0 | GraphPad | -- |
| 包装病毒 | Lipo293转染试剂 | Beyotime | C0521 |
| PEG8000 | -- | -- | |
| 假病毒中和实验 | 萤火虫荧光素酶检测试剂 | Beyotime | RG051 |
| 空斑减少实验 | 结晶紫 | -- | -- |
| 计算机模拟 | Data Warrior | -- | -- |
| BOILED-Egg模型 | -- | -- | |
| SwissADME | -- | -- | |
| ProTox | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| BLI筛选 | 化合物浓度800 μM，RBD蛋白浓度10 ng/mL，基线、结合、解离时间分别为60、120、120秒，阳性对照EGCG浓度100 μM 阅读提示：Materials and methods 2.4 生物层干涉法 |
| 细胞毒性 | 细胞密度1×10^4/孔，化合物处理48小时，MTT浓度0.5 mg/mL，作用4小时，IC50拟合 阅读提示：Materials and methods 2.7 细胞毒性测定 |
| ELISA | 化合物浓度25-200 μM，试剂盒品牌和货号 阅读提示：Materials and methods 2.5 ELISA |
| 免疫荧光 | 化合物浓度0-100 μM，RBD蛋白（delta plus和omicron BA.1），ACE2-EGFP过表达细胞 阅读提示：Materials and methods 2.6 免疫荧光染色 |
| 假病毒中和 | 细胞HEK293T-hACE2，假病毒种类（delta、omicron），化合物浓度范围，检测时间48小时，RLU值 阅读提示：Materials and methods 2.9 假病毒中和实验 |
| 真实病毒中和 | Vero E6细胞密度1×10^4/孔，病毒株和TCID50（100），化合物浓度，CPE观察时间3天，空斑实验条件（0.8%琼脂，72小时），TCID50测定时间48小时 阅读提示：Materials and methods 2.10 真实SARS-CoV-2中和实验、2.11 空斑减少实验、2.12 TCID50测定 |