动物分组与既往免疫
建立既往Ad26.COV2.S免疫的猕猴模型，并随机分配至不同加强组，以比较不同加强策略的效果。
28只先前接受过Ad26.COV2.S不同方案免疫的恒河猴，根据免疫方案、体重、年龄及抗体水平分层，分为四组（每组7只）；另有8只接种过Ad26.HIV疫苗的猕猴作为Sham-Sham对照组，6只接受过生理盐水注射的猕猴作为Sham-Ad26.COV2.S.529组，后者接受单次Ad26.COV2.S.529免疫。
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用Ad26.COV2.S或Omicron适应性疫苗加强免疫可增强猕猴对SARS-CoV-2 Omicron的免疫应答和保护效果
Booster with Ad26.COV2.S or Omicron-adapted vaccine enhanced immunity and efficacy against SARS-CoV-2 Omicron in macaques.
实验完整度
高研究涵盖体外中和抗体、记忆B细胞及T细胞分析，以及病毒攻击后的病毒载量和组织病理学评估，证据层级多样。
主要模型
雌性中国恒河猴（Macaca mulatta） 非人类灵长类Omicron BA.1攻击模型 Ad26.COV2.S既往免疫模型
重点核对
加强免疫疫苗及剂量：Ad26.COV2.S 5×10^10 vp，Ad26.COV2.S.529 5×10^10 vp，或两者组合总剂量5×10^10 vp 攻击病毒株：SARS-CoV-2 Omicron BA.1，剂量1×10^6 PFU，经鼻内和气管内途径给予 攻击时间：加强免疫或初次免疫后6周 主要检测终点：中和抗体滴度(psVNA NT50)、结合抗体滴度(ELISA)、记忆B细胞频率、T细胞应答(ELISpot/ICS)、BAL及鼻腔病毒载量(sgRNA) 动物分组：每组7只(Sham-Ad26.COV2.S.529组6只，Sham-Sham组8只)
摘要
Omicron刺突蛋白(S)编码疫苗作为加强免疫，是提高COVID-19疫苗针对Omicron有效性的潜在策略。在此，先前接种过Ad26.COV2.S的猕猴（主要为雌性），分别用Ad26.COV2.S、Ad26.COV2.S.529（编码Omicron BA.1 S）或这两种疫苗的1:1组合进行加强免疫。所有加强免疫均能迅速诱导针对WA1/2020和Omicron S的抗体滴度升高。针对Omicron BA.1和BA.2的抗体应答，含Ad26.COV2.S.529的疫苗诱导效果最佳。无论使用哪种疫苗，检测到的主要是WA1/2020反应性或WA1/2020-Omicron BA.1交叉反应性B细胞。与仅用Ad26.COV2.S加强免疫相比，含Ad26.COV2.S.529的加强疫苗对Omicron BA.1攻击下呼吸道的保护作用仅略有提高。抗体和细胞免疫应答被确定为互补的保护相关性指标。总体而言，与基于原始Wuhan-Hu-1刺突蛋白的疫苗相比，基于Omicron刺突蛋白的疫苗加强免疫仅能适度提高免疫应答和保护效果，而原始疫苗仍能提供针对Omicron的强效免疫应答和保护。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 在先前接种Ad26.COV2.S的猕猴中，使用Omicron适应性疫苗(Ad26.COV2.S.529)或与原始疫苗联合作为加强免疫，是否比单独使用原始疫苗(Ad26.COV2.S)能更有效地增强针对Omicron的免疫应答和保护效果？
- 核心机制
- Omicron适应性加强疫苗通过缓解免疫印记，诱导针对Omicron特异性表位的新生抗体应答，从而提供更强的保护；而原始疫苗加强主要回召预先存在的交叉反应性记忆B细胞。
- 主要证据
- Ad26.COV2.S.529或联合加强组在攻击后BAL中病毒载量峰值显著低于Ad26.COV2.S组，且Omicron BA.1和BA.2中和抗体及结合抗体滴度更高，但总体保护差异较小。
- 研究意义
- 研究支持在Omicron流行背景下，原始Wuhan-Hu-1刺突蛋白疫苗加强仍能提供强效保护，Omicron适应性疫苗仅提供适度改善，为疫苗策略的进一步优化提供了依据。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
加强免疫及体液免疫应答评估
评估不同加强疫苗对中和抗体和结合抗体应答的诱导能力及其动力学。
各加强组接受相应疫苗或组合（总剂量5×10^10 vp）免疫，在加强后第1、2、4、6周采集血液，通过psVNA和ELISA分别检测针对WA1/2020、Omicron BA.1和BA.2的中和抗体和RBD结合抗体滴度。
细胞免疫应答评估
评估加强免疫对记忆B细胞和T细胞应答的影响，以及这些细胞应答与保护效果的关系。
在加强后6周，通过流式细胞术检测PBMC中RBD特异性记忆B细胞频率；通过IFN-γ ELISpot和胞内细胞因子染色评估T细胞应答。
Omicron BA.1攻击实验及病毒载量评估
评估不同加强策略对Omicron BA.1感染的保护效果，主要以下呼吸道病毒载量为指标。
加强后6周，所有动物经鼻内和气管内途径接种1×10^6 PFU的SARS-CoV-2 Omicron BA.1。攻击后第1、2、4、7、10、13/14天收集BAL和鼻腔拭子，通过sgRNA RT-PCR检测病毒载量。
组织病理学评估
评估不同加强策略对Omicron BA.1感染引起的肺病理变化的保护效果。
攻击后第13/14天处死动物，收集肺部组织进行大体病理检查和H&E染色组织病理学评估，采用盲法评分。
保护相关性分析
确定免疫应答参数（中和抗体、结合抗体、T细胞）与下呼吸道保护效果的相关性，建立预测模型。
使用Spearman秩相关评估加强后6周的Omicron BA.1中和抗体滴度、结合抗体滴度及ELISpot T细胞应答与BAL AUC病毒载量的相关性；并构建线性回归模型预测病毒载量。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证体内保护效果
数据分析与统计
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 中和抗体检测 | psPAX2包装质粒 | AIDS Reagent | 11348 |
| pLenti CMV Puro LUC荧光素酶报告质粒 | Addgene | 17447 | |
| Lipofectamine 2000转染试剂 | Sigma | -- | |
| Steady-Glo荧光素酶检测试剂盒 | Promega | -- | |
| 结合抗体检测 | 抗猕猴IgG辣根过氧化物酶 | NIH Non-human Primate Reagent Resource | 1b3-HRP; |
| TMB SureBlue启动液 | SeraCare | -- | |
| TMB终止液 | SeraCare | -- | |
| VersaMax酶标仪 | Molecular Devices | -- | |
| Omega酶标仪 | BMG Labtech | -- | |
| 抗体广度检测 | ECLA板 | Meso Scale Discovery | -- |
| MESO QuickPlex SQ 120 | Meso Scale Discovery | -- | |
| B细胞分析 | Aqua LIVE/DEAD染料 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| Fc受体阻断剂 | BD Biosciences | -- | |
| CD45抗体 | BD Biosciences | 742055 | |
| CD3抗体 | BD Biosciences | 557757 | |
| CD7抗体 | BD Biosciences | 561603 | |
| CD123抗体 | Biolegend | 306040 | |
| CD11c抗体 | Biolegend | 301648 | |
| CD20抗体 | BD Biosciences | 555624 | |
| IgG抗体 | BD Biosciences | 612819 | |
| IgM抗体 | BD Biosciences | 563903 | |
| CD27抗体 | BD Biosciences | 741366 | |
| CD21抗体 | BD Biosciences | 740395 | |
| CD14抗体 | Biolegend | 301832 | |
| WA1/2020 RBD生物素 | Sino Biological | 40592-V08B-B | |
| BV650链霉亲和素 | BD Bioscience | 563855 | |
| WA1/2020 RBD蛋白 | Sino Biological | 40592-V08B | |
| FITC偶联试剂盒（快速）- Lightning-Link® | Abcam | ab188285 | |
| SARS-CoV-2 B.1.1.529 (Omicron BA.1) RBD蛋白 | Sino Biological | 40592-V08H121 | |
| DyLight® 405偶联试剂盒（快速）- Lightning-Link® | Abcam | ab201798 | |
| Alexa Fluor® 647偶联试剂盒（快速）- Lightning-Link® | Abcam | ab269823 | |
| BD FACSymphony™流式细胞仪 | BD Biosciences | -- | |
| FlowJo软件 | BD Bioscience | v10 | |
| T细胞分析 | IFN-γ包被抗体 | U-Cytech | CT243 |
| 氮蓝四唑/5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸盐底物 | -- | -- | |
| CD49d抗体 | -- | -- | |
| CD28抗体 | BD Biosciences | 555730 | |
| GolgiStop | BD Biosciences | -- | |
| GolgiPlug | BD Biosciences | -- | |
| Aqua LIVE/DEAD™染料 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| CD279抗体 | BD Biosciences | 566460 | |
| CD38抗体 | NIH NHP Reagent Resource | RRID: | |
| CD4抗体 | BD Biosciences | 563094 | |
| CD95抗体 | BD Biosciences | 612790 | |
| CD8抗体 | BD Biosciences | 612889 | |
| BD Cytofix/Cytoperm™固定/破膜液 | BD Biosciences | -- | |
| BD Perm/Wash™缓冲液 | BD Biosciences | -- | |
| Ki67抗体 | BD Biosciences | 561165 | |
| CD69抗体 | Beckman Coulter | 6607110 | |
| IL10抗体 | Biolegend | 501420 | |
| IL13抗体 | BD Biosciences | 563580 | |
| TNF-α抗体 | BD Biosciences | 563418 | |
| IL4抗体 | BD Biosciences | 564112 | |
| IFN-γ抗体 | BD Biosciences | 563563 | |
| IL2抗体 | BD Biosciences | 554567 | |
| CD45抗体 | BD Biosciences | 751117 | |
| CD3抗体 | BD Biosciences | 557917 | |
| BD FACSymphony™系统 | BD Biosciences | -- | |
| FlowJo v10软件 | BD Biosciences | -- | |
| 病毒载量检测 | QIAcube HT自动核酸提取仪 | QIAGEN | -- |
| IndiSpin QIAcube HT病原体提取试剂盒 | QIAGEN | -- | |
| SuperScript VILO预混液 | Invitrogen | -- | |
| TaqMan定制基因表达分析试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| QuantStudio 6和7 Flex实时PCR系统 | Applied Biosystems | -- | |
| 组织病理学 | Aperio扫描仪 | Leica Biosystems | -- |
| Halo Link浏览器 | Indica Labs | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 动物模型与分组 | 猕猴种类、来源、年龄、体重、性别分布；既往免疫方案（单次或两次Ad26.COV2.S，剂量及间隔）；分组方法（依据抗体滴度、体重、年龄等） 阅读提示：Methods: Animals, Study design animal experiments |
| 疫苗接种 | 疫苗类型（Ad26.COV2.S、Ad26.COV2.S.529或组合）、剂量（5×10^10 vp）、接种途径（肌肉注射）、加强时间（初次免疫后约20个月） 阅读提示：Methods: Vaccines, Study design animal experiments |
| 免疫应答评估 | 采血时间点（加强后0、1、2、4、6周）；psVNA检测的假病毒类型及稀释系列；ELISA检测的抗原（RBD蛋白）、起始稀释度及系列稀释；ECLA检测的血清稀释度 阅读提示：Methods: ELISA, psVNA, ECLA |
| 细胞免疫评估 | PBMC分离及保存条件；memory B细胞检测的抗体克隆及荧光标记；ELISpot检测的肽库覆盖区域及浓度；ICS检测的肽库浓度、抗体克隆及刺激时间 阅读提示：Methods: B cell profiling, ELISpot, ICS |
| 病毒攻击及病毒载量检测 | 攻击病毒株（Omicron BA.1）、剂量（1×10^6 PFU）、途径（鼻内及气管内）；攻击时间（加强后6周）；病毒载量检测方法（sgRNA RT-PCR）、采样时间点（第1、2、4、7、10、13/14天）、检测灵敏度（50 copies/mL或/swab） 阅读提示：Methods: Study design animal experiments, RNA isolation and BA.1 SARS-CoV-2 subgenomic mRNA assay |
| 组织病理学 | 组织取样部位（鼻粘膜、咽、气管、支气管、肺）、固定液（10%中性福尔马林）、切片染色（H&E）、评分标准 阅读提示：Methods: Lung gross pathology and histopathology |