融合蛋白设计与染料标记
验证RBD和ACE2经Halo/SNAP标签标记后仍保持活性，并可用于荧光成像。
将Halo标签融合至RBD的C端，SNAP标签融合至ACE2的N端，表达并纯化融合蛋白，用Halo-SiR和SNAP-Cy3/Alexa488标记，通过SDS-PAGE和荧光成像验证特异性结合。
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SIM成像解析活细胞中SARS-CoV-2刺突蛋白RBD的内吞作用
SIM imaging resolves endocytosis of SARS-CoV-2 spike RBD in living cells.
实验完整度
高包含体外蛋白标记、活细胞共聚焦与SIM动态成像、多种抑制剂干预、Western blot验证及荧光定量分析，并功能验证RBD内吞及降解过程。
主要模型
HeLa细胞 HEK293T细胞 Caco-2细胞 Vero细胞 H1299细胞 s-ACE2过表达细胞
重点核对
s-ACE2过表达HeLa细胞 h-RBD-SiR浓度25 nM 抑制剂浓度：dynasore 50 μM、HCQ 50 μM、CQ 50 μM、BafA1 100 nM、NH4Cl 20 mM、RBD-NAb 40 nM SIM成像时间点：1 h, 6 h, 10 h, 17 h 使用Pearson相关系数定量共定位
摘要
为了预防和治疗COVID-19，迫切需要了解严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）的感染机制。SARS-CoV-2的感染始于病毒刺突蛋白的受体结合域（RBD）与宿主细胞的血管紧张素转换酶2（ACE2）结合，但结合后的内吞细节尚不清楚。在这里，RBD和ACE2被基因编码并用有机染料标记，以追踪活细胞中的RBD内吞。光稳定的染料能够进行长期的结构照明显微镜（SIM）成像，并通过RBD/ACE2荧光的强度比来量化RBD-ACE2结合（RAB）。我们解析了活细胞中RAB的内吞过程，包括RBD-ACE2识别、辅因子调节的膜内化、含RAB囊泡的形成和运输、RAB降解以及ACE2的下调。发现RAB激活了RBD的内化。囊泡在细胞内运输和成熟后，RAB最终被溶酶体摄取后降解。该策略是理解SARS-CoV-2感染机制的有前景的工具。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- SARS-CoV-2 RBD与ACE2结合后的内吞过程及其机制是什么？
- 核心机制
- RBD与ACE2的结合激活了RBD的内化，通过网格蛋白介导的内吞途径形成囊泡，囊泡沿微管运输并成熟为早期和晚期内体，最终与溶酶体融合，RBD-ACE2复合物被溶酶体降解，而未结合RBD的ACE2可能被回收。
- 主要证据
- 通过SIM成像实时追踪活细胞中RBD和ACE2的荧光标记，观察到RBD-ACE2识别、膜内化、囊泡形成与运输、溶酶体降解等过程；通过抑制剂实验和荧光定量分析验证了内吞依赖网格蛋白；通过Western blot验证了RBD和ACE2的降解。
- 研究意义
- 该研究提供了理解SARS-CoV-2感染机制的新见解，可能有助于发现新的治疗靶点，并为研究病毒内吞过程提供了活细胞成像策略。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
活细胞RBD-ACE2结合成像
观察RBD与ACE2在细胞表面的结合，并评估融合蛋白修饰对活性的影响。
在活细胞中，用共聚焦显微镜同时标记s-ACE2-Cy3和h-RBD-SiR，观察二者共定位；加入RBD中和抗体竞争结合，验证结合特异性；通过测量荧光强度比计算EC50。
内吞起始与抑制剂分析
确定RBD内吞是否依赖RAB以及是否由网格蛋白介导，并评估多种抑制剂的影响。
在s-ACE2过表达HeLa细胞中，加入h-RBD-SiR和SNAP-Alexa488，实时监测内吞囊泡的形成；使用dynasore（网格蛋白抑制剂）、HCQ、CQ、BafA1、NH4Cl等抑制剂预处理，测量细胞膜和胞质荧光强度比，分析内吞程度。
SIM动态追踪囊泡运输与成熟
观察RAB囊泡的运输轨迹和成熟过程（从早期内体到晚期内体）。
使用SIM成像追踪含有s-ACE2和h-RBD的囊泡沿微管的运动，并通过共表达Rab5-EGFP和Rab7-mCherry标记早期和晚期内体，计算Pearson相关系数评估共定位变化。
溶酶体降解与ACE2下调
验证RBD和ACE2最终被溶酶体降解，并观察ACE2在细胞膜上的下调。
使用Lyso561标记溶酶体，LAMP1-mCherry标记溶酶体膜，通过SIM成像观察RAB囊泡与溶酶体的融合；用Western blot检测RBD和ACE2的降解；测量细胞膜上ACE2荧光强度的变化。
刺突蛋白三聚体内吞验证
验证全长刺突蛋白与RBD具有相似的内吞和降解过程。
表达并标记spike-T-mGam，通过SIM成像观察其与s-ACE2的结合和内吞，评估其与Rab7共定位和降解情况。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 蛋白表达与纯化 | Ni-NTA树脂 | -- | -- |
| 蛋白标记 | Halo-SiR | -- | -- |
| SNAP-Cy3 | New England BioLabs | S9112S | |
| SNAP-Alexa 488 | New England BioLabs | S9129S | |
| 细胞染色 | Hoechst 33342 | ThermoFisher | 62249 |
| 细胞培养 | Lipofectamine 3000 | ThermoFisher | L3000008 |
| 聚乙烯亚胺MAX 40K | Polysciences | 24765 | |
| SMM 293-TI培养基 | Sino Biological | -- | |
| M293-SUPI补充物 | Sino Biological | -- | |
| 溶酶体标记 | Lyso561染料 | KeyGEN BioTECH | KGMP006 |
| 药物处理 | 巴弗洛霉素A1 | MedChemExpress | HY-100558 |
| MCA-APK(Dnp)-OH | Beyotime | P9737 | |
| 达纳索尔 | TargetMOI | T1848 | |
| 羟氯喹 | Sigma-Aldrich | H0915 | |
| 氯喹 | Innochem | A88133 | |
| 抗体 | SARS-CoV-2 RBD中和抗体兔单克隆抗体 | Sino Biological | 40592-R001 |
| ACE2小鼠单克隆抗体 | Proteintech | 66699-1-Ig | |
| SARS-CoV-2 Spike RBD小鼠单克隆抗体 | ABclonal | A20141 | |
| HRP偶联山羊抗小鼠IgG(H+L) | Proteintech | SA00001-1 | |
| 小鼠抗β-肌动蛋白单克隆抗体 | Proteintech | 66009-1-Ig | |
| 罗丹明(TRITC)偶联山羊抗小鼠IgG(H+L) | Proteintech | SA00007-1 | |
| 细胞培养 | HeLa细胞系 | -- | CCL-2 |
| HEK293T细胞系 | -- | CRL3216 | |
| NCI-H1299细胞系 | -- | CRL-5803 | |
| Vero细胞系 | -- | CCL-81 | |
| Caco-2细胞系 | -- | HTB-37 | |
| Expi293F™细胞系 | ThermoFisher | A14527 | |
| 荧光成像 | 荧光分光光度计 | Agilent | -- |
| 激光扫描共聚焦显微镜 | Andor | iQ | |
| N-SIM超分辨显微镜系统 | Nikon | -- | |
| 蛋白表达 | Ni-NTA树脂 | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 融合蛋白表达与标记 | 细胞系、转染试剂、表达培养基、标记染料及浓度 阅读提示：STAR Methods: Fusion protein expression and purification; Probe synthesis |
| 活细胞结合成像 | 细胞密度、转染量、染料浓度、成像时间、显微镜设置 阅读提示：STAR Methods: Live-cell imaging of RBD-ACE2 interaction; Figure 1F |
| 内吞抑制剂实验 | 抑制剂种类及浓度、预处理时间、h-RBD浓度、成像时间点 阅读提示：STAR Methods: Live-cell evaluation of inhibitors; Figure 2 |
| SIM动态追踪 | 共表达质粒、染料浓度、成像时间间隔和时长、显微镜设置 阅读提示：STAR Methods: SIM dynamics imaging; Figures 3 and S3 |
| 溶酶体降解实验 | Lyso561浓度、成像时间点、BafA1浓度 阅读提示：STAR Methods: SIM imaging to resolve the destinations; Figure 4 |