非人灵长类模型验证
验证SARS-CoV-2感染是否导致肾小球屏障功能障碍
非洲绿猴接种SARS-CoV-2后，检测血浆suPAR水平、白蛋白尿、肾脏组织学和足细胞形态。
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suPAR通过快速改变足细胞功能介导病毒反应性蛋白尿
SuPAR mediates viral response proteinuria by rapidly changing podocyte function.
实验完整度
高包含非人灵长类感染模型、小鼠体内模型、细胞实验（人足细胞）、SPR生物物理分析和临床队列验证，并进行了功能验证（抗体阻断、疫苗接种）和机制验证（整合素结合）。
主要模型
非洲绿猴（SARS-CoV-2感染模型） suPAR转基因小鼠（suPAR-Tg） 人足细胞（条件永生化）
重点核对
非洲绿猴感染模型：接种2019-nCoV/USA-WA1/2020株，剂量分为吸入组和多重途径暴露组 小鼠模型：2.5 ng/g体重S1蛋白鼻内吸入，每日一次，持续10天 suPAR抗体阻断：MAB531，500 μg/kg体重，腹腔注射，每3天一次，共4次 疫苗接种：BNT162b2单次肌注，0.25 μg/g体重，然后S1蛋白吸入 临床队列：1991例COVID-19患者，suPAR水平与蛋白尿的关联，按变异株分层
摘要
可溶性尿激酶受体（suPAR）升高和蛋白尿是中度至重度2019冠状病毒病（COVID-19）患者的常见体征。在此，我们描述了一种作为病毒反应一部分的新型蛋白尿。接种严重急性呼吸综合征冠状病毒2型（SARS-CoV-2）可导致非洲绿猴的suPAR水平升高和肾小球病变。在使用具有高suPAR表达的工程化小鼠模型中，吸入型SARS-CoV-2刺突S1蛋白变体可引发蛋白尿，该蛋白尿可通过suPAR抗体或SARS-CoV-2疫苗接种阻断。在1991例COVID-19患者队列中，suPAR水平与非Omicron（而非Omicron）感染的蛋白尿呈逐步关联，支持了我们对SARS-CoV-2刺突S1蛋白变体之间生物物理和功能差异及其与足细胞整合素结合的研究结果。这些发现不仅限于SARS-CoV-2，并将病毒反应性蛋白尿（VRP）定义为一种先天免疫机制和足细胞整合素的共激活。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 病毒蛋白和宿主suPAR如何相互作用导致蛋白尿？
- 核心机制
- suPAR与病毒蛋白（如SARS-CoV-2 S1蛋白）协同激活足细胞αvβ3整合素，导致足细胞损伤和蛋白尿。
- 主要证据
- 非洲绿猴感染SARS-CoV-2后出现suPAR升高和肾小球病变；suPAR-Tg小鼠吸入S1蛋白出现蛋白尿，可被suPAR抗体或疫苗接种阻断；人足细胞实验中S1蛋白诱导αvβ3整合素活性，可被αvβ3抗体抑制。
- 研究意义
- 本研究定义了病毒反应性蛋白尿（VRP）作为先天免疫机制和足细胞整合素共激活，可能对病毒相关蛋白尿疾病具有广泛意义。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
小鼠模型建立
确定S1蛋白和suPAR在诱导蛋白尿中的因果作用
通过鼻内吸入2019-nCov S1蛋白10天，检测不同基因型小鼠的蛋白尿和足突融合。
干扰措施验证
验证阻断suPAR或SARS-CoV-2疫苗能否预防蛋白尿
给予suPAR单克隆抗体或BNT162b2疫苗后，观察S1蛋白诱导的蛋白尿是否被抑制。
特异性和变异株测试
检验蛋白尿是否依赖特定病毒蛋白和病毒变异株
在suPAR-Tg小鼠中，分别接种核衣壳蛋白、Delta S1、Omicron S1、HIV-1 gp120、HCV E2和流感B HA蛋白，检测蛋白尿。
分子机制探索
揭示S1蛋白与suPAR及整合素的相互作用
通过共免疫沉淀、SPR和细胞实验，检测S1蛋白与suPAR和αvβ3整合素的结合亲和力，以及S1蛋白对足细胞蛋白表达和αvβ3活性的影响。
临床队列关联分析
验证suPAR水平与COVID-19患者蛋白尿的关联是否依赖变异株
分析M2C2队列中1991例患者，比较非Omicron和Omicron感染者的suPAR水平与蛋白尿的关联。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证样本或模型特征
验证细胞功能变化
验证分子表达变化
数据分析与统计
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| SARS-CoV-2感染模型 | 2019-nCoV/USA-WA1/2020 | -- | -- |
| 小鼠模型建立 | 重组2019-nCov刺突S1蛋白 | Abeomics | 32-190005 |
| suPAR阻断 | 大鼠抗小鼠uPAR单克隆抗体 | R&D Systems | MAB531 |
| 疫苗接种 | BNT162b2（复必泰） | Pfizer-BioNTech | -- |
| 尿液分析 | 小鼠白蛋白ELISA试剂盒 | Bethyl | E99-134 |
| 肌酐比色法试剂盒 | Cayman | #500701 | |
| 血清检测 | 肌酐检测试剂盒 | Sigma | MAK080 |
| 尿素氮比色检测试剂盒 | Invitrogen | EIABUN | |
| 细胞因子检测 | 多因子检测系统，促炎因子板1（小鼠） | MSD | -- |
| 免疫沉淀 | Fugene 6转染试剂 | Promega | E2692 |
| 蛋白酶抑制剂混合物 | Roche | 04693116001 | |
| 磷酸酶抑制剂混合物2和3 | Sigma | P5726 and P0044 | |
| Pierce蛋白A/G琼脂糖 | Thermo Scientific | 20421 | |
| Myc小鼠单克隆抗体 | Sigma | M4439 | |
| 小鼠抗V5抗体 | Invitrogen | 46-075 | |
| 抗C9抗体 | Abnova | PAB26959 | |
| 小鼠抗Flag抗体 | Sigma | F1804 | |
| 单克隆抗His抗体 | Invitrogen | MA1-21315 | |
| SPR实验 | SARS-CoV-2 (2019-nCov)刺突S1蛋白 | Abclonal | RP01262 |
| SARS-CoV-2 Omicron (B.1.1.529)刺突S1蛋白 | Sino Biological | 40591-V08H41 | |
| 人整合素αvβ3 | R&D Systems | 3817-AV-050 | |
| 人ACE2 | Abclonal | RP01266 | |
| Biacore T200 | GE Healthcare | -- | |
| 细胞培养和处理 | RPMI-1640培养基 | Invitrogen | -- |
| 胰岛素-转铁蛋白-硒 | Sigma | -- | |
| 人suPAR | R&D Systems | 807-UK-100/CF | |
| αvβ3整合素单克隆抗体（LM609） | Millipore | MAB1976 | |
| 小鼠IgG1同型对照 | Invitrogen | 02-6100 | |
| 免疫荧光 | 山羊抗人ACE2 | R&D Systems | AF933 |
| 小鼠抗人β3整合素抗体AP5 | Kerafast | EBW107 | |
| 兔抗人podocin | Sigma | P0372 | |
| Alexa Fluor偶联二抗 | Invitrogen | A21200, A21442, A21468 | |
| LSM 700共聚焦显微镜 | Carl Zeiss | -- | |
| 临床检测 | suPARnostic检测 | Virogates | -- |
| 尿液电泳 | Pierce™考马斯亮蓝（Bradford）检测试剂盒 | ThermoFisher Scientific | 23236 |
| NuPage 4-12% Bis-Tris凝胶 | ThermoFisher Scientific | NP0322BOX | |
| 牛血清白蛋白（BSA） | Biorad | 500-0207 | |
| Imperial蛋白染色 | ThermoFisher Scientific | 24615 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 非人灵长类模型 | 感染剂量和途径：吸入约2×10^3 TCID50，或多种途径累计3.61×10^6 PFU 阅读提示：Methods: Nonhuman primate SARS-CoV-2 infection model |
| 小鼠模型 | S1蛋白剂量2.5 ng/g体重，每日一次，连续10天；小鼠品系（C57BL/6，Plaur−/−，suPAR-Tg） 阅读提示：Methods: SARS-CoV-2 spike S1 protein inoculation mouse models |
| suPAR阻断 | uPAR单克隆抗体（MAB531）500 μg/kg体重，腹腔注射，每3天一次，共4次 阅读提示：Methods: SARS-CoV-2 spike S1 protein inoculation mouse models |
| 疫苗接种 | BNT162b2剂量0.25 μg/g体重，单次肌注；11天后开始S1蛋白吸入 阅读提示：Methods: SARS-CoV-2 spike S1 protein inoculation mouse models |
| 临床队列 | suPAR水平在入院48小时内测定；蛋白尿分级标准；变异株分组时间点 阅读提示：Methods: SuPAR levels and proteinuria in patients with COVID-19 |