鉴定PD-1相互作用蛋白
寻找调控PD-1蛋白稳定性的去泛素化酶。
在HEK293T细胞中表达PD-1-cHA，通过免疫沉淀结合质谱分析鉴定潜在的PD-1相互作用蛋白。
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ERK和USP5通过去泛素化调控PD-1稳态以调节肿瘤免疫治疗
ERK and USP5 govern PD-1 homeostasis via deubiquitination to modulate tumor immunotherapy.
实验完整度
高包含体外生化实验（IP/MS、GST pull-down、去泛素化）、细胞功能实验、小鼠肿瘤模型（MC38、LLC、CT26、KP）及患者样本mIHC分析，并进行了机制验证。
主要模型
HEK293T细胞 Jurkat和MOLT-4细胞 小鼠原代CD3+ T细胞 MC38、LLC、CT26、E.G7-OVA肿瘤小鼠模型
重点核对
USP5与PD-1的相互作用及去泛素化活性（UBA1/2结构域） ERK对PD-1 Thr234位点的磷酸化及其对PD-1-USP5结合的影响 T细胞中Usp5条件性敲除（Usp5fl/flCd4-Cre）对肿瘤生长的影响 EOAI3402143与Trametinib或抗CTLA-4联合治疗的叠加效应 患者结直肠癌组织中USP5与PD-1的共定位
摘要
程序性细胞死亡蛋白1（PD-1）是T细胞上的抑制性受体，在促进癌症免疫逃逸中发挥重要作用。虽然已有报道调控PD-1稳定性的泛素E3连接酶，但调控PD-1稳态以调节肿瘤免疫治疗的去泛素化酶仍不明确。在此，我们鉴定出泛素特异性蛋白酶5（USP5）是PD-1的真正去泛素化酶。机制上，USP5与PD-1相互作用，导致PD-1去泛素化和稳定。此外，细胞外信号调节激酶（ERK）磷酸化PD-1的Thr234位点，并促进PD-1与USP5的相互作用。T细胞中条件性敲除Usp5可增加效应细胞因子的产生并减缓小鼠肿瘤生长。USP5抑制联合Trametinib或抗CTLA-4对抑制小鼠肿瘤生长具有叠加效应。总之，本研究描述了ERK/USP5介导的PD-1调控的分子机制，并确定了增强抗肿瘤疗效的潜在联合治疗策略。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 调控PD-1稳态以影响肿瘤免疫治疗的去泛素化酶及其机制是什么？
- 核心机制
- ERK磷酸化PD-1 Thr234，促进PD-1与USP5的相互作用，USP5去除PD-1上的K48链接泛素化，从而稳定PD-1，抑制T细胞抗肿瘤功能。
- 主要证据
- 通过IP/MS鉴定USP5为PD-1相互作用蛋白，体外去泛素化实验证实USP5直接去除PD-1泛素化；突变PD-1 T234A破坏其与USP5的结合并增加泛素化；Usp5 cKO小鼠中PD-1表达降低，CD8+ T细胞效应功能增强，肿瘤生长减缓。
- 研究意义
- 揭示了ERK/USP5介导的PD-1调控机制，为癌症免疫治疗提供了潜在的联合治疗策略，如USP5抑制剂联合MEK抑制剂或抗CTLA-4抗体。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
验证USP5对PD-1蛋白的调控作用
确认USP5是否通过去泛素化酶活性稳定PD-1蛋白。
过表达或敲低USP5，检测PD-1蛋白和mRNA水平，并使用CHX分析PD-1蛋白半衰期。
分析USP5与PD-1的相互作用和去泛素化
明确USP5与PD-1的结合区域及去泛素化活性。
通过co-IP、GST pull-down和体外去泛素化实验，确定USP5的UBA1/2结构域与PD-1胞内区（192-240）相互作用，并去除K48链接泛素化。
验证ERK介导的PD-1磷酸化
探究ERK是否磷酸化PD-1的Thr234位点并影响其稳定性。
通过体外激酶实验、质谱和p-T234-PD-1抗体验证ERK磷酸化PD-1 T234；使用MEK抑制剂（Trametinib、Ulixertinib）或敲低ERK1/2观察PD-1蛋白水平变化。
验证ERK磷酸化促进PD-1与USP5相互作用
确定ERK介导的PD-1 T234磷酸化是否促进PD-1与USP5结合。
通过co-IP、GST pull-down和合成肽结合实验，检测ERK激活或抑制对PD-1-USP5相互作用的影响，并鉴定USP5 UBA1/2结构域中的关键残基。
评估USP5在T细胞中的功能
研究USP5对CD8+ T细胞效应功能和抗肿瘤能力的影响。
利用Usp5 cKO小鼠，检测CD8+ T细胞活化标志物、细胞因子产生，以及皮下MC38和LLC肿瘤模型的生长。
测试联合治疗策略
评估USP5抑制联合MEK抑制剂或抗CTLA-4对肿瘤生长的叠加效应。
在CT26和MC38肿瘤模型中，使用EOAI3402143、Trametinib或抗CTLA-4单药或联合治疗，监测肿瘤生长和生存期。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证蛋白相互作用
验证磷酸化
数据分析与统计
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | RPMI 1640培养基 | Hyclone | -- |
| DMEM培养基 | Hyclone | -- | |
| 胎牛血清 | Gibco | -- | |
| 白细胞介素-2 | Stemcell | 78081 | |
| 药物处理 | EOAI3402143 | MedChemExpress | HY-111408 |
| 曲美替尼 | MedChemExpress | HY-10999 | |
| Ulixertinib | MedChemExpress | HY-15816 | |
| MG132 | MedChemExpress | HY-13259 | |
| 衣霉素 | MedChemExpress | HY-A0098 | |
| Western blot | 抗PD-1 (D4W2J) 兔单克隆抗体 | Cell Signaling Technology | 86163 |
| 抗USP5兔多克隆抗体 | ABclonal Technology | A4202 | |
| 抗K48连接特异性多聚泛素兔多克隆抗体 | Cell Signaling Technology | 4289 | |
| 抗Flag M2亲和凝胶 | Sigma-Aldrich | A2220 | |
| 抗HA琼脂糖 | Sigma-Aldrich | A2095 | |
| 流式分析 | 流式细胞仪 | Beckman | Cytoflex |
| 流式细胞仪 | BD Biosciences | -- | |
| 动物实验 | 抗小鼠PD-1抗体（克隆：29F.1A12） | -- | -- |
| 抗小鼠CTLA-4抗体（克隆：9H10） | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养 | 细胞系来源（HEK293T、Jurkat、MOLT-4、CT26、MC38、E.G7-OVA），培养基、血清、添加因子（IL-2、2-巯基乙醇等）及培养条件。 阅读提示：Methods: Cell culture, transfection, and virus infection |
| 质粒和shRNA构建 | 使用的载体（pcDNA3.1、pCMV-cFlag、pGEX-GST-6P、Retro-pMSCV、pLKO.1）、shRNA序列、突变体（C335A、T234A等）。 阅读提示：Methods: Constructs |
| 蛋白相互作用分析 | IP缓冲液（EBC）、洗涤缓冲液（NETN）、抗体（抗HA、抗Flag、抗PD-1）、孵育时间和温度。 阅读提示：Methods: Immunoprecipitation (IP) and immunoblot (IB) |
| 去泛素化实验 | MG132处理浓度和时间，Ni-NTA pull-down缓冲液，体外去泛素化反应条件（缓冲液、温度、时间），重组USP5蛋白来源。 阅读提示：Methods: In vivo deubiquitination assay; In vitro deubiquitination assay |
| 激酶实验 | 重组GST-PD-1片段，活性ERK1激酶来源，ATP-γ-S和PNBM浓度，反应时间。 阅读提示：Methods: In vitro kinase assay |
| 小鼠肿瘤模型 | 小鼠品系（C57BL/6J、BALB/c），细胞接种数量，处理药物（Trametinib剂量、EOAI3402143、抗体），给药途径和时间。 阅读提示：Methods: Mice; Methods: Chemical reagents; Figure legends for Figs. 5, 6 |
| 原代T细胞功能分析 | 小鼠品系（OT-1、Usp5 cKO），CD8+ T细胞分离方法，刺激条件（抗CD3/CD28浓度，时间），细胞因子检测。 阅读提示：Methods: Mouse primary T cell isolation and effector function analysis; Figure 5 |