沉默Rac1和Prex1抑制转化生长因子-β1诱导的人胃癌细胞上皮-间质转化

Silencing Rac1 and Prex1 Inhibit Epithelial-Mesenchymal Transition in Human Gastric Cancer Cells Induced by Transforming Growth Factor-β1.

作者信息Xinyan Gao, Xiaoyan Lin, Mengxin Lin, Yanqin Lan, Yao Wang, Riping Wu, Junde Li, Chuanyong Huang, Dongta Zhong
PMID37434402
发布时间2023-09
DOI10.5152/tjg.2023.23108

实验完整度

中

包含细胞模型、RNA干扰、功能检测(活力、迁移、凋亡)及蛋白表达验证,但缺乏体内实验和机制深度验证。

主要模型

人胃癌细胞系MGC-803 人胃癌细胞系MKN45

重点核对

rTGF-β1处理浓度10 ng/mL Rac1和Prex1 siRNA干扰序列及其转染效率 细胞活力检测使用CCK-8试剂盒,波长450 nm 迁移实验检测时间为0-24小时,每组5个重复 凋亡检测使用Annexin V-FITC/propidium iodide染色

摘要

背景/目的:转化生长因子-β可影响肿瘤细胞,导致上皮-间质转化并增强其侵袭和转移能力。Rac1蛋白可作为独立的肿瘤诊断标志物和生存预测因子。Prex1与细胞转移密切相关。本研究探讨了沉默Rac1和Prex1对转化生长因子-β1诱导的人胃癌细胞MGC-803和MKN45上皮-间质转化及凋亡的影响。材料与方法:MGC-803和MKN45细胞接受不同浓度的重组转化生长因子-β1(rTGF-β1)处理。使用Cell Counting Kit-8试剂盒测定细胞活力。将Rac1和Prex1干扰载体转染至经rTGF-β1处理的MGC-803和MKN45细胞中。分别通过流式细胞术和划痕实验检测细胞凋亡和迁移。使用Western blot检测上皮-间质转化相关标志物E-钙黏蛋白、N-钙黏蛋白、波形蛋白和PDLIM2的表达水平。结果:rTGF-β1(10 ng/mL)可促进MGC-803和MKN45细胞活力。沉默Rac1和Prex1可增加E-钙黏蛋白和PDLIM2表达,降低N-钙黏蛋白和波形蛋白表达,抑制细胞活力和迁移,并促进rTGF-β1处理的MGC-803和MKN45细胞凋亡。结论:沉默Rac1和Prex1可抑制人胃癌细胞的上皮-间质转化,降低细胞活力和迁移,并促进凋亡。

实验结论

提炼研究问题、关键发现与证据,快速把握文章的核心贡献。

研究问题
沉默Rac1和Prex1对TGF-β1诱导的人胃癌细胞上皮-间质转化、凋亡和细胞活力的影响。
核心机制
Rac1和Prex1可能作为TGF-β1的下游靶基因参与胃癌细胞EMT过程,沉默二者可上调PDLIM2表达,抑制EMT。
主要证据
在MGC-803和MKN45细胞中,沉默Rac1和Prex1后,Western blot显示E-钙黏蛋白和PDLIM2表达升高,N-钙黏蛋白和波形蛋白降低,同时细胞活力、迁移受抑,凋亡增加。
研究意义
本研究为EMT相关疾病的治疗提供了新思路和新途径。

研究路径

按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。

1

细胞培养与EMT模型建立

确定最佳rTGF-β1浓度以诱导胃癌细胞发生上皮-间质转化。

MGC-803和MKN45细胞在含10% FBS的DMEM中培养,用不同浓度rTGF-β1处理24小时,通过CCK-8检测细胞活力。

2

RNA干扰载体构建与转染

验证Rac1和Prex1 siRNA的干扰效率,并建立基因沉默模型。

针对Rac1和Prex1基因设计并构建siRNA干扰载体,转染至MGC-803和MKN45细胞,通过Western blot验证干扰效率。

3

细胞功能检测

评估沉默Rac1和Prex1对胃癌细胞活力、迁移和凋亡的影响。

采用CCK-8检测细胞活力,划痕实验检测迁移能力,流式细胞术检测凋亡率。

4

EMT相关标志物检测

验证沉默Rac1和Prex1对EMT标志物表达的影响。

通过Western blot检测E-钙黏蛋白、N-钙黏蛋白、波形蛋白和PDLIM2的表达水平。

研究方法

按研究目的归类文中使用的方法,便于定位所需技术。

细胞功能验证
蛋白表达检测
基因干扰

产品清单

实验环节名称品牌货号
MGC-803细胞Chinese Academy of SciencesTCHu
MKN45细胞Procell Life Science & Technology Co., Ltd.CL-0292
杜尔贝科改良伊格尔培养基Nanjing KeyGen Biotech Co., Ltd.KGM12800S-500
胎牛血清----
青霉素-链霉素Hyclone Laboratories--
胰蛋白酶EDTA消化液SolarbioT1300
脂质体3000转染试剂Invitrogen™L3000015
重组转化生长因子-β1Sino Biological10804-H08H1
细胞计数试剂盒-8Nanjing KeyGen Biotech Co., Ltd.KGA317
BCA蛋白定量试剂盒Beijing ComWin Biotech Co., Ltd.CW0014S
增强化学发光Perkin-Elmer Inc.--
膜联蛋白V-FITC分析试剂盒Beyotime Biotechnology--
多功能酶标仪Shanghai Flash Spectrum Biotechnology Co., Ltd.SuPerMax

关键环节

汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。

环节核对要点
细胞培养与EMT模型
细胞系:MGC-803、MKN45;rTGF-β1浓度梯度:0、5、10、20、50 ng/mL;处理时间:24小时
阅读提示:Methods:Cell Culture and Establishment of Epithelial–Mesenchymal Transition Models of MGC-803 and MKN45 Cells
RNA干扰与转染
siRNA序列(见表1);转染试剂Lipofectamine 3000;转染时间:48小时
阅读提示:Methods:Construction of Rac1 and Prex1 RNA Interference Vectors;Cell Transfection
细胞活力检测
细胞接种密度:7000细胞/孔;CCK-8孵育时间:2小时;检测波长:450 nm
阅读提示:Methods:Cell Counting Kit-8 Assay
迁移实验
划痕宽度测量0-24小时;重复数:每组5个;细胞密度:>90%
阅读提示:Methods:Cell Migration Detection
凋亡检测
细胞密度:1 × 10^6/mL;Annexin V-FITC体积:3 μL;PI体积:5 μL;孵育条件:4°C暗处10分钟;重复次数:3次
阅读提示:Methods:Flow Cytometry for Cell Apoptosis
Western Blot
蛋白上样量:50 μg/泳道;电泳:12% SDS-PAGE;内参:GAPDH
阅读提示:Methods:Western Blot