细胞培养与EMT模型建立
确定最佳rTGF-β1浓度以诱导胃癌细胞发生上皮-间质转化。
MGC-803和MKN45细胞在含10% FBS的DMEM中培养,用不同浓度rTGF-β1处理24小时,通过CCK-8检测细胞活力。
Silencing Rac1 and Prex1 Inhibit Epithelial-Mesenchymal Transition in Human Gastric Cancer Cells Induced by Transforming Growth Factor-β1.
包含细胞模型、RNA干扰、功能检测(活力、迁移、凋亡)及蛋白表达验证,但缺乏体内实验和机制深度验证。
人胃癌细胞系MGC-803 人胃癌细胞系MKN45
rTGF-β1处理浓度10 ng/mL Rac1和Prex1 siRNA干扰序列及其转染效率 细胞活力检测使用CCK-8试剂盒,波长450 nm 迁移实验检测时间为0-24小时,每组5个重复 凋亡检测使用Annexin V-FITC/propidium iodide染色
提炼研究问题、关键发现与证据,快速把握文章的核心贡献。
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
确定最佳rTGF-β1浓度以诱导胃癌细胞发生上皮-间质转化。
MGC-803和MKN45细胞在含10% FBS的DMEM中培养,用不同浓度rTGF-β1处理24小时,通过CCK-8检测细胞活力。
验证Rac1和Prex1 siRNA的干扰效率,并建立基因沉默模型。
针对Rac1和Prex1基因设计并构建siRNA干扰载体,转染至MGC-803和MKN45细胞,通过Western blot验证干扰效率。
评估沉默Rac1和Prex1对胃癌细胞活力、迁移和凋亡的影响。
采用CCK-8检测细胞活力,划痕实验检测迁移能力,流式细胞术检测凋亡率。
验证沉默Rac1和Prex1对EMT标志物表达的影响。
通过Western blot检测E-钙黏蛋白、N-钙黏蛋白、波形蛋白和PDLIM2的表达水平。
按研究目的归类文中使用的方法,便于定位所需技术。
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | MGC-803细胞 | Chinese Academy of Sciences | TCHu |
| MKN45细胞 | Procell Life Science & Technology Co., Ltd. | CL-0292 | |
| 杜尔贝科改良伊格尔培养基 | Nanjing KeyGen Biotech Co., Ltd. | KGM12800S-500 | |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| 青霉素-链霉素 | Hyclone Laboratories | -- | |
| 胰蛋白酶EDTA消化液 | Solarbio | T1300 | |
| 细胞转染 | 脂质体3000转染试剂 | Invitrogen™ | L3000015 |
| 药物处理 | 重组转化生长因子-β1 | Sino Biological | 10804-H08H1 |
| 细胞活力检测 | 细胞计数试剂盒-8 | Nanjing KeyGen Biotech Co., Ltd. | KGA317 |
| 蛋白定量 | BCA蛋白定量试剂盒 | Beijing ComWin Biotech Co., Ltd. | CW0014S |
| Western Blot | 增强化学发光 | Perkin-Elmer Inc. | -- |
| 凋亡检测 | 膜联蛋白V-FITC分析试剂盒 | Beyotime Biotechnology | -- |
| 吸光度读取 | 多功能酶标仪 | Shanghai Flash Spectrum Biotechnology Co., Ltd. | SuPerMax |
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养与EMT模型 | 细胞系:MGC-803、MKN45;rTGF-β1浓度梯度:0、5、10、20、50 ng/mL;处理时间:24小时 阅读提示:Methods:Cell Culture and Establishment of Epithelial–Mesenchymal Transition Models of MGC-803 and MKN45 Cells |
| RNA干扰与转染 | siRNA序列(见表1);转染试剂Lipofectamine 3000;转染时间:48小时 阅读提示:Methods:Construction of Rac1 and Prex1 RNA Interference Vectors;Cell Transfection |
| 细胞活力检测 | 细胞接种密度:7000细胞/孔;CCK-8孵育时间:2小时;检测波长:450 nm 阅读提示:Methods:Cell Counting Kit-8 Assay |
| 迁移实验 | 划痕宽度测量0-24小时;重复数:每组5个;细胞密度:>90% 阅读提示:Methods:Cell Migration Detection |
| 凋亡检测 | 细胞密度:1 × 10^6/mL;Annexin V-FITC体积:3 μL;PI体积:5 μL;孵育条件:4°C暗处10分钟;重复次数:3次 阅读提示:Methods:Flow Cytometry for Cell Apoptosis |
| Western Blot | 蛋白上样量:50 μg/泳道;电泳:12% SDS-PAGE;内参:GAPDH 阅读提示:Methods:Western Blot |