CRISPR-Cas9全基因组筛选
鉴定参与B19V VP1u内化的宿主因子
在UT7/Epo-S1细胞中转导CRISPR-Cas9敲除文库，通过两轮基于GFP-VP1u5-68aa内化的流式细胞分选，富集GFP阴性细胞群，通过NGS测序鉴定sgRNA富集基因。
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鉴定AXL为人细小病毒B19感染人红系祖细胞的共受体
Identification of AXL as a co-receptor for human parvovirus B19 infection of human erythroid progenitors.
实验完整度
高包含CRISPR筛选、基因沉默、抗体/蛋白抑制、BLI结合实验及细胞系/原代EPC模型等多层级验证。
主要模型
UT7/Epo-S1细胞系 体外扩增的人CD36+红系祖细胞（EPCs） K562细胞系
重点核对
CRISPR-Cas9筛选使用GFP-VP1u5-68aa内化作为报告 shRNA沉默AXL后B19V内化减少约90%（EPCs） 重组AXL胞外域（rAXLEC）及抗AXL抗体抑制B19V感染呈剂量依赖性 BLI测定AXL与VP1u结合KD为103 nM AXL在B19V许可细胞表面高表达，非许可细胞低表达
摘要
细小病毒B19（B19V）感染人红系祖细胞（EPCs）并引起多种血液疾病和胎儿水肿。次要衣壳蛋白VP1的5-68氨基酸（aa5-68）区域（VP1u5-68aa）是B19V进入EPCs的最小受体结合域。在此，我们进行了全基因组CRISPR-Cas9 guide RNA筛选，并鉴定出酪氨酸蛋白激酶受体UFO（AXL）作为B19V感染EPCs的蛋白性受体。在体外扩增的EPCs中沉默AXL基因显著降低了B19V的内化和复制。感染时加入重组AXL胞外域或其多克隆抗体可有效抑制B19V对体外扩增EPCs的感染。此外，B19V VP1u在体外与重组AXL胞外域以相对较高的亲和力（KD = 103 nM）相互作用。总之，我们提供证据表明AXL是B19V感染EPCs的共受体。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- BX19V进入人红系祖细胞所依赖的蛋白性共受体是什么？
- 核心机制
- AXL作为共受体，通过其胞外域直接与B19V VP1u的独特区相互作用，介导病毒进入细胞。
- 主要证据
- CRISPR-Cas9筛选鉴定AXL；shRNA沉默AXL显著抑制B19V内化和复制；rAXLEC及抗AXL抗体阻断感染；BLI显示高亲和结合（KD=103 nM）。
- 研究意义
- AXL可作为B19V感染所致疾病抗病毒药物开发的潜在靶点。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
验证AXL对VP1u内化的作用
验证AXL沉默是否影响GFP-VP1u5-68aa的内化
用shRNA沉默UT7/Epo-S1细胞中AXL表达，通过免疫荧光和流式细胞术检测GFP-VP1u5-68aa的内化。
验证AXL对B19V感染的影响（细胞系）
评估AXL沉默对B19V进入、复制和释放的影响
在UT7/Epo-S1细胞中沉默AXL后感染B19V，用qPCR检测内化病毒基因组、病毒DNA复制、VP2 mRNA表达及释放病毒。
验证AXL对B19V感染的影响（原代EPCs）
验证AXL在原代红细胞祖细胞中的功能
在体外扩增的CD36+ EPCs中沉默AXL，检测B19V进入、复制、衣壳蛋白表达。
抗体/蛋白抑制实验
通过阻断AXL或中和病毒来验证AXL在B19V感染早期步骤中的作用
在B19V感染过程中，将抗AXL多克隆抗体或重组AXL胞外域与CD36+ EPCs孵育，检测B19V DNA复制。
AXL与VP1u相互作用分析
确定AXL与B19V VP1u是否直接相互作用
通过免疫荧光检测AXL与B19V病毒粒子的共定位；通过BLI测定rAXLEC与GST-VP1u的结合动力学。
AXL表达与B19V准许性相关性分析
评估AXL在细胞表面的表达是否与B19V感染准许性相关
通过Western blot和流式细胞术检测多种细胞系中AXL表达；在K562细胞中过表达AXL，检测B19V进入和复制。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
CRISPR筛选
蛋白相互作用分析
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Cytiva Life Science | SH30022.01 |
| 胎牛血清 | MilliporeSigma | F0926 | |
| 促红细胞生成素 | Amgen | -- | |
| 青霉素 | -- | -- | |
| 链霉素 | -- | -- | |
| RPMI 1640培养基 | Cytiva | SH30027 | |
| 病毒定量 | 病原体DNA/RNA快速提取试剂盒 | Zymo Research Co. | R1042 |
| RNA提取 | TRIzol试剂 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| CRISPR筛选 | 人Brunello CRISPR敲除混合文库 | Addgene | 73179-LV |
| 嘌呤霉素 | Sigma-Aldrich | P8833 | |
| 血液和细胞培养DNA大提试剂盒 | Qiagen | 13362 | |
| 基因沉默 | shAXL | MilliporeSigma | TRCN0000001040 |
| shScramble | MilliporeSigma | SHC016V | |
| 基因过表达 | 表达AXL的慢病毒 | -- | 116714 |
| 基因表达定量 | 随机引物 | Invitrogen | 48190011 |
| WB | PVDF膜 | MilliporeSigma | IPVH00010 |
| 增强化学发光底物 | -- | -- | |
| WB影像 | Fuji LAS 4000成像系统 | Cytiva | -- |
| LI-COR Odyssey成像系统 | LI-COR Corporate | -- | |
| 细胞增殖 | CytoTox-Glo细胞毒性检测试剂盒 | Promega | G9290 |
| 流式分析 | LSR II流式细胞仪 | BD Biosciences | -- |
| FACSDiva软件 | BD Biosciences | -- | |
| FlowJo软件 | FlowJo LLC | -- | |
| 免疫荧光 | 抗B19V衣壳抗体（克隆521-5D） | MilliporeSigma | MAB8292 |
| 抗B19V衣壳抗体（MAB 860-55D） | MIKROGEN | -- | |
| 山羊抗AXL抗体 | R&D Systems | AF154 | |
| 小鼠抗β-肌动蛋白抗体 | MilliporeSigma | A5441 | |
| WB | 兔抗AXL抗体 | Cell Signaling Technology | 8661S |
| 抗Ku80抗体 | Cell Signaling Technology | 2180 | |
| 抗整合素α5抗体 | Cell Signaling Technology | 98204 | |
| 小鼠抗Flag抗体 | Rockland | 200-301-B13 | |
| 细胞增殖 | 兔抗BrdU抗体 | Rockland | 600-401-C29 |
| 流式/IFA | FITC标记抗小鼠IgG | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 715-095-151 |
| Texas Red标记抗山羊IgG | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 705-075-003 | |
| Cy-5标记抗山羊IgG | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 705-175-003 | |
| WB | HRP标记抗兔IgG | MilliporeSigma | A0545 |
| HRP标记抗山羊IgG | MilliporeSigma | AP106P | |
| HRP标记抗小鼠IgG | MilliporeSigma | A4416 | |
| BLI | Ni-NTA生物传感器 | FortéBio/Sartorius | 18-5101 |
| BLItz生物层干涉系统 | FortéBio/Sartorius | -- | |
| 药物处理 | R428 | APExBio | A8329 |
| 蛋白纯化 | 重组AXL蛋白 | Sino Biological | 10279-H08H |
| 重组人Ku80蛋白 | Abcam | ab132946 | |
| 天然整合素α5β1复合物 | R&D Systems | 3230-A5 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养 | UT7/Epo-S1细胞培养条件：DMEM+10%FBS+Epo（2 U/ml）+青霉素/链霉素；CD36+ EPCs分化条件：Wong培养基，常氧至第4天，低氧（1% O2）2天后使用（第9天） 阅读提示：Materials and Methods: Primary cells and cell lines |
| CRISPR筛选 | 转导文库：Human Brunello CRISPR Knockout Pooled Library，MOI=0.3；嘌呤霉素浓度2.5 μg/ml；筛选两轮；GFP-VP1u5-68aa浓度2 μM 阅读提示：Materials and Methods: Genome-wide CRISPR gRNA screen |
| 病毒定量 | B19V感染MOI=1000（UT7/Epo-S1和EPC）或2000（K562）；内化病毒检测需trypsin和benzonase处理；病毒DNA复制检测以线粒体DNA标准化；VP2 mRNA检测以β-actin标准化 阅读提示：Materials and Methods: Virus infection and quantification |
| 基因沉默 | shAXL（#TRCN0000001040）和shScramble转导MOI=5；转导后嘌呤霉素筛选浓度2.5 μg/ml，时间7天 阅读提示：Materials and Methods: Lentivirus production, transduction, and quantification of AXL gene silencing |
| 抗体/蛋白抑制 | 抗AXL抗体（#AF154）或IgG对照浓度（0.5-100 μg/ml）；rAXLEC或MBP浓度（1-10 μM）；感染前4°C孵育 阅读提示：Materials and Methods: Antibody/protein inhibition of B19V infection |
| 结合动力学 | BLI条件：rAXLEC浓度4 μM；GST-VP1u浓度梯度；KD=103 nM 阅读提示：Materials and Methods: BLI assay |