转录组分析
分析PTB患者与健康对照外周血中S100A4和GSDMD的表达差异及富集通路。
利用GEO数据库GSE83456数据集，比较健康人（N=61）和PTB患者（N=45）外周血转录组，分析S100A4和GSDMD表达、相关性、ROC曲线，并进行KEGG富集分析。
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S100A4通过激活NF-κB/NLRP3炎症小体信号通路促进BCG诱导的巨噬细胞焦亡
S100A4 Promotes BCG-Induced Pyroptosis of Macrophages by Activating the NF-κB/NLRP3 Inflammasome Signaling Pathway.
实验完整度
高包含患者外周血转录组分析、细胞模型功能验证（siRNA、外源蛋白、抑制剂）、通路机制验证（NF-κB/NLRP3抑制剂）等多层级实验。
主要模型
THP-1巨噬细胞（人单核细胞系） BCG感染的THP-1巨噬细胞模型 肺结核患者外周血样本
重点核对
BCG感染MOI=10 si-S100A4转染24小时 外源性S100A4浓度1.5 μg/mL NF-κB抑制剂TPL浓度5 nM NLRP3抑制剂MCC950浓度10 μM
摘要
焦亡是宿主防御结核分枝杆菌（Mtb）感染的免疫策略。S100A4是一种钙结合蛋白，在促进癌症进展以及各种非肿瘤疾病的病理生理发展中起重要作用，但在Mtb感染宿主中的作用尚未被探索。在本研究中，对肺结核（PTB）患者外周血的转录组分析显示，PTB患者外周血中S100A4和GSDMD显著上调。此外，GSDMD与S100A4的表达呈正相关。KEGG通路富集分析显示，PTB患者与健康对照之间的差异表达基因与炎症显著相关，如NOD样受体信号通路和NF-κB信号通路。为了研究S100A4对巨噬细胞焦亡的调节作用，用外源性S100A4、S100A4抑制剂或si-S100A4预处理感染牛分枝杆菌卡介苗（BCG）的THP-1巨噬细胞。本研究表明，S100A4促进BCG感染引起的THP-1巨噬细胞焦亡，并激活NLRP3炎症小体和NF-κB信号通路，而敲低或抑制S100A4可抑制这些作用。此外，抑制NF-κB或NLRP3可阻断S100A4对BCG诱导的THP-1巨噬细胞焦亡的促进作用。总之，S100A4激活NF-κB/NLRP3炎症小体信号通路，促进Mtb感染诱导的巨噬细胞焦亡。这些数据为S100A4如何影响Mtb诱导的巨噬细胞焦亡提供了新的见解。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- S100A4在结核分枝杆菌感染诱导的巨噬细胞焦亡中扮演何种角色及其潜在机制？
- 核心机制
- S100A4通过激活NF-κB/NLRP3炎症小体信号通路促进BCG诱导的巨噬细胞焦亡。
- 主要证据
- PTB患者外周血中S100A4和GSDMD上调且正相关；BCG感染的THP-1巨噬细胞中S100A4敲低或抑制降低焦亡相关蛋白表达，外源性S100A4增强焦亡；NF-κB或NLRP3抑制剂阻断S100A4的促进作用。
- 研究意义
- 研究揭示了S100A4在Mtb感染诱导巨噬细胞焦亡中的作用，加深了对病原体感染过程中细胞炎症和焦亡信号通路复杂调控机制的理解。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
BCG感染时间梯度实验
观察BCG感染THP-1巨噬细胞后S100A4表达和焦亡相关指标的变化。
以MOI=10感染THP-1巨噬细胞，在不同时间点（0、2、6、12、24、48h）检测S100A4、GSDMD表达，细胞活力，IL-1β和IL-18分泌，以及细胞形态。
S100A4敲低实验
验证敲低S100A4对BCG诱导的巨噬细胞焦亡和NLRP3炎症小体活化的影响。
用si-S100A4转染THP-1巨噬细胞24小时，再BCG感染，检测焦亡相关蛋白（GSDMD-N、IL-1β、IL-18）和炎症小体相关蛋白（NLRP3、Caspase-1、ASC）的表达及细胞因子释放。
外源性S100A4和抑制剂处理
验证外源性S100A4促进焦亡，而S100A4抑制剂Niclosamide抑制焦亡。
THP-1巨噬细胞分别用外源性S100A4（1.5 μg/mL）或Niclosamide（1 μM）预处理2小时，再感染BCG 24小时，检测S100A4、GSDMD-N和NLRP3蛋白表达。
通路抑制剂实验
验证NF-κB和NLRP3在S100A4促进焦亡中的作用。
用TPL（NF-κB抑制剂）或MCC950（NLRP3抑制剂）预处理，再联合外源性S100A4和BCG感染，检测相关蛋白表达。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | RPMI-1640培养基 | -- | -- |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| 佛波酯 | -- | -- | |
| 细菌培养 | Middlebrooks 7H9肉汤培养基 | BD | M1315 |
| 油酸白蛋白葡萄糖过氧化氢酶 | BD Diagnostic Systems | -- | |
| 吐温-80 | -- | -- | |
| siRNA转染 | LipofectamineTM RNAi MAX试剂 | -- | -- |
| 抑制剂处理 | 雷公藤甲素 | MedChemExpress | HY-32735 |
| MCC950 | MedChemExpress | HY-12815 | |
| 外源蛋白处理 | 外源性S100A4 | Sino Biological | 10185-H01H |
| 抑制剂处理 | 氯硝柳胺 | MedChemExpress | HY-B0497 |
| Western blot | 抗S100A4抗体 | Proteintech | 16105-1-AP |
| β-肌动蛋白抗体 | Proteintech | 20536-1-AP | |
| 抗GSDMD-N抗体 | Cell Signaling Technology | 39754S | |
| 抗Caspase-1 p48抗体 | Cell Signaling Technology | 3866S | |
| 抗ASC抗体 | Cell Signaling Technology | 13833S | |
| 抗NLRP3抗体 | Cell Signaling Technology | 15101S | |
| 抗IL-1β p17抗体 | Cell Signaling Technology | 83186S | |
| 抗IL-18抗体 | Cell Signaling Technology | 54943S | |
| 化学发光试剂盒 | Absin | -- | |
| Amersham Imager 6000成像仪 | GE Healthcare | -- | |
| qRT-PCR | Trizol试剂 | -- | -- |
| 免疫荧光 | FITC标记的山羊抗兔IgG（H+L） | Proteintech | SA00001-2 |
| DAPI | -- | -- | |
| 倒置荧光显微镜 | Olympus | -- | |
| 透射电镜 | 日立H-7650电子显微镜 | Hitachi | -- |
| ELISA | 人IL-1β ELISA试剂盒 | Boster | EK0392 |
| 人IL-18 ELISA试剂盒 | Boster | EK0864 | |
| CCK-8 | 细胞计数试剂盒-8 | Absin | abs50003 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养与BCG感染 | THP-1细胞来源；PMA浓度50 ng/mL；诱导时间48小时；BCG感染MOI=10；感染时间24小时 阅读提示：见Materials and Methods 4.2 Cell Culture and Infection |
| siRNA转染 | si-S100A4序列；转染试剂Lipofectamine RNAi MAX；转染时间24小时 阅读提示：见Materials and Methods 4.3 Small Interfering RNA Transfection和Table 2 |
| 药物处理 | TPL浓度5 nM；MCC950浓度10 μM；外源性S100A4浓度1.5 μg/mL；Niclosamide浓度1 μM；预处理时间2小时 阅读提示：见Materials and Methods 4.4 Chemicals and Inhibitors Treatment |
| Western blot | 抗体及稀释比例（β-actin 1:3000，S100A4 1:1000等） 阅读提示：见Materials and Methods 4.5 Western Blot |
| qRT-PCR | 引物序列（Table 3）；内参β-actin 阅读提示：见Materials and Methods 4.6 Quantitative Reverse-Transcription PCR和Table 3 |
| ELISA | IL-1β和IL-18 ELISA试剂盒货号 阅读提示：见Materials and Methods 4.9 Enzyme-Linked Immunosorbent Assay |