底物噬菌体库构建
构建随机七肽噬菌体库，用于展示蛋白酶候选底物序列。
使用Kunkel诱变构建Lib 7X噬菌体库，在M13噬菌体的pIII蛋白上展示随机七肽，并在N端包含AviTag。
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利用底物噬菌体展示结合蛋白质网络分析鉴定SARS-CoV-2 PLpro和3CLpro的人源蛋白质组底物
Identification of SARS-CoV-2 PLpro and 3CLpro human proteome substrates using substrate phage display coupled with protein network analysis.
实验完整度
中包含底物噬菌体展示、NGS、蛋白质网络分析和体外切割验证，但主要验证为体外生化实验，缺乏细胞或动物模型等独立证据层级。
主要模型
M13噬菌体展示的随机七肽库 重组人CDH6、CDH12和CD177蛋白
重点核对
底物噬菌体库的构建与生物素标记 PLpro和3CLpro的浓度及孵育时间 体外切割反应缓冲液与温度 质谱分析验证切割位点
摘要
病毒蛋白酶在病毒复制中发挥关键作用，它们还通过蛋白水解多种靶蛋白促进免疫逃逸。深入分析宿主细胞中的病毒蛋白酶底物有助于理解病毒发病机制和抗病毒药物发现。在此，我们利用底物噬菌体展示结合蛋白质网络分析，鉴定了严重急性呼吸综合征冠状病毒2型（SARS-CoV-2）病毒蛋白酶（包括木瓜样蛋白酶（PLpro）和3C样蛋白酶（3CLpro））的人源蛋白质组底物。我们首先对PLpro和3CLpro进行了肽底物筛选，然后使用排名前24的优选底物序列鉴定了总共290个推定蛋白底物。蛋白质网络分析显示，PLpro和3CLpro底物蛋白的前缀簇分别包含泛素相关蛋白和钙粘蛋白相关蛋白。我们通过体外切割实验验证了cadherin-6和cadherin-12是3CLpro的新底物，CD177是PLpro的新底物。因此，我们证明了底物噬菌体展示结合蛋白质网络分析是一种简单且高通量的方法，可用于鉴定SARS-CoV-2病毒蛋白酶的人源蛋白质组底物，以进一步理解病毒-宿主相互作用。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 如何系统鉴定SARS-CoV-2 PLpro和3CLpro的人源蛋白质组底物？
- 核心机制
- PLpro和3CLpro通过特异性切割宿主蛋白（如CDH6、CDH12和CD177）来调节宿主反应，促进免疫逃逸和病毒传播。
- 主要证据
- 通过底物噬菌体展示和NGS获得底物序列，结合UniProt数据库鉴定290个推定底物；体外切割实验和质谱分析验证CDH6（SILQ↓G）和CDH12（SILQ↓G）为3CLpro底物，CD177（HLSGG↓）为PLpro底物。
- 研究意义
- 该研究提供了一种简单且高通量的方法，用于鉴定病毒蛋白酶底物，有助于理解病毒-宿主相互作用和抗病毒药物开发。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
底物噬菌体筛选
通过噬菌体展示选择PLpro和3CLpro的优选底物序列。
生物素标记噬菌体库，固定在链霉亲和素包被板上，用PLpro或3CLpro孵育切割，收集释放的噬菌体并扩增，进行四轮筛选，逐渐缩短孵育时间。
NGS测序和数据分析
对筛选出的噬菌体进行测序，计算富集分数，提取底物序列。
从每轮筛选的噬菌体提取DNA，用带条形码的引物扩增七肽编码片段，进行Illumina 150PE测序；处理数据计算富集分数，并绘制seqLogo。
推定底物识别和网络分析
识别包含优选底物序列的人类蛋白质，并分析其相互作用网络。
在UniProt人类蛋白质组数据库（UP000005640）中搜索包含前24个底物序列的蛋白质，共鉴定101个PLpro推定底物和189个3CLpro推定底物；使用STRING进行网络分析和MCL聚类。
体外切割验证
验证新预测底物CDH6、CDH12和CD177是否被蛋白酶切割。
将重组CDH6、CDH12与3CLpro共孵育，CD177与PLpro共孵育，通过SDS-PAGE分析切割产物。
切割位点确认
确证切割位点与预测是否一致。
使用PNGase F去糖基化后，通过高分辨率质谱分析切割片段的精确质量，并与计算质量比对；对于CD177，直接分析反应液。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 噬菌体库构建 | 大肠杆菌CJ236菌株、电转感受态TG1（Lucigen）、Kunkel诱变方法 阅读提示：Experimental procedures: Construction of substrate phage library |
| 底物噬菌体筛选 | 生物素标记条件（BirA浓度、ATP浓度、生物素浓度、温度、时间）；噬菌体库浓度；包被板类型；孵育时间序列；蛋白酶浓度；缓冲液组成 阅读提示：Experimental procedures: Substrate phage selection of PLpro and 3CLpro |
| NGS样品制备和数据 | 引物条形码序列、PCR扩增条件、测序平台、生物信息学脚本 阅读提示：Experimental procedures: NGS sample preparation and data analysis |
| 蛋白质网络分析 | STRING版本、数据库物种（人类）、MCL聚类参数（膨胀参数3） 阅读提示：Experimental procedures: NGS sample preparation and data analysis |
| 体外切割验证 | 底物蛋白浓度、蛋白酶浓度、缓冲液、温度、时间 阅读提示：Experimental procedures: Protein substrates verification assay in vitro |
| 切割位点确认 | PNGase F用量、孵育条件、质谱仪设置 阅读提示：Experimental procedures: Cleavage site confirmation assay |