非经典氨基酸的合成与遗传编码
设计和合成含有叠氮和四嗪双手柄的非经典氨基酸pTAF和mTAF，并验证它们能否通过遗传密码子扩展引入蛋白质。
合成了pTAF和mTAF，通过定向进化获得pTAFRS和R2-74RS合成酶，将pTAF和mTAF引入sfGFP和抗体片段中，通过质谱和SDS-PAGE验证。
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非经典氨基酸作为双重生物正交手柄用于一锅法制备蛋白质多偶联物
Noncanonical amino acids as doubly bio-orthogonal handles for one-pot preparation of protein multiconjugates.
实验完整度
高包含化学合成、遗传编码、体外正交性验证、细胞实验、小鼠体内成像与治疗实验等多个独立证据层级，并进行了功能与机制验证。
主要模型
E. coli BL21(DE3)表达系统 HER2-scFv抗体片段 J591 Fab抗体片段 22Rv1和HCC1954荷瘤裸鼠模型
重点核对
ncAA的遗传编码效率（pTAF和mTAF的掺入） 叠氮和四嗪反应的相互正交性 蛋白偶联物的均质性和纯度 抗体片段的结合活性和特异性 体内成像和治疗的剂量及时间窗
摘要
非经典氨基酸（ncAA）的遗传编码用于位点特异性蛋白质修饰已被广泛用于许多生物学和治疗应用。为了高效制备均质的蛋白质多偶联物，我们设计并编码了两种非经典氨基酸，4-(6-(3-叠氮丙基)-s-四嗪-3-基)苯丙氨酸（pTAF）和3-(6-(3-叠氮丙基)-s-四嗪-3-基)苯丙氨酸（mTAF），它们包含相互正交且生物正交的叠氮和四嗪反应手柄。含有TAF的重组蛋白和抗体片段可以通过一锅反应轻松地以即插即用的方式与商业可得的荧光团、放射性同位素、PEG和药物组合功能化，从而获得蛋白质双偶联物，用于评估小鼠模型中肿瘤诊断、图像引导手术和靶向治疗的组合。此外，我们证明通过两个无义密码子同时将mTAF和含酮的非经典氨基酸整合到一个蛋白质中，可以制备位点特异性的蛋白质三偶联物。我们的结果表明，TAF是双重生物正交手柄，用于高效、可规模化的制备均质蛋白质多偶联物。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 如何通过遗传编码非经典氨基酸实现蛋白质的多重位点特异性偶联，以制备功能多样的蛋白质偶联物？
- 核心机制
- 利用含有叠氮和四嗪两个相互正交生物正交手柄的非经典氨基酸pTAF/mTAF，通过SPAAC和IEDDA反应实现一锅双标记，并可结合其他ncAA实现三标记。
- 主要证据
- 通过质谱、SDS-PAGE和荧光成像验证了双标记蛋白的均质性；在小鼠模型中证明了Fab-PEG-NIRF偶联物用于肿瘤成像、64Cu标记的PET/荧光双模态成像以及scFv-MMAE-PEG偶联物的抗肿瘤活性。
- 研究意义
- 该平台为高效、可规模化制备均质蛋白质多偶联物提供了通用方法，有望扩展蛋白质药物的功能，并推动个性化医疗应用。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
双正交反应验证
验证pTAF中的叠氮和四嗪基团能否进行相互正交的点击化学反应，而不发生交叉反应。
使用HER2-scFv-pTAF，分别或同时与DBCO-CY5和TCO-PEG3-FITC反应，通过SDS-PAGE、荧光成像和质谱分析产物。
抗体片段-近红外染料-PEG双偶联物的制备与成像
评估抗体片段双偶联物在体内肿瘤成像中的应用，特别是近红外荧光成像。
将J591 Fab-A121-pTAF与DBCO-CY7和TCO-PEG20K一锅反应制备双偶联物，注射到22Rv1荷瘤小鼠中，进行体内荧光成像和离体器官分析。
双模态PET和荧光图像引导手术
验证双标记的抗体片段用于PET成像和手术导航的可行性。
将J591 Fab-A121-pTAF与DBCO-CY5和TCO-NOTA偶联，并用64Cu标记，注射到22Rv1荷瘤小鼠中，进行micro-PET成像和荧光引导手术。
抗体片段-PEG-药物双偶联物的制备与抗肿瘤活性
制备HER2-scFv-PEG-MMAE双偶联物，评估其体外细胞毒性和体内抗肿瘤效果。
将HER2-scFv-A121-pTAF与DBCO-MMAE和TCO-PEG20K或40K偶联，通过MTT实验测定IC50，并在HCC1954荷瘤小鼠中评估抗肿瘤活性。
双ncAA掺入制备蛋白质三偶联物
证明通过同时掺入mTAF和pAcF两种ncAA，可以实现蛋白质的三重位点特异性修饰。
将mTAF和pAcF同时掺入HER2-scFv（S9TAG和K42TAA），然后与hydrazide-CY5、DBCO-CY3和TCO-PEG20K进行三标记反应，通过荧光凝胶成像验证。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| ncAA合成 | 4-溴丁腈 | -- | -- |
| Boc-L-4-氰基苯丙氨酸 | -- | -- | |
| 蛋白表达 | pET22b载体 | Invitrogen | -- |
| pULTRA载体 | Addgene | 48215 | |
| pEVOL载体 | Addgene | 31186 | |
| 蛋白纯化 | Ni-NTA亲和层析 | -- | -- |
| 蛋白偶联 | DBCO-CY5 | Confluore | BCD-34 |
| DBCO-CY7 | Confluore | BCD-22 | |
| DBCO-CY3 | Confluore | BCD-30 | |
| DBCO-(PEG)3-VC-PAB-MMAE | MedChemExpress | HY-111012 | |
| TCO-PEG20K | Confluore | BGNH-45 | |
| TCO-PEG40K | Confluore | BGNH-46 | |
| TCO-PEG3-NOTA | Ruixibio | R-056 | |
| 动力学测定 | sTCO-CycP-PEG2-OH | Confluore | BCT-32 |
| 细胞培养 | RPMI 1640培养基 | -- | -- |
| DMEM培养基 | -- | -- | |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| 青霉素-链霉素 | -- | -- | |
| L-谷氨酰胺 | -- | -- | |
| GlutaMax-I | -- | -- | |
| 胰蛋白酶 | -- | -- | |
| 流式分析 | CytoFlex流式细胞仪 | Beckman Coulter | -- |
| 荧光成像 | Hoechst 33342 | Beyotime Biotechnology | -- |
| LysoTracker Green | Beyotime Biotechnology | -- | |
| DAPI | -- | -- | |
| 体内成像 | IVIS Spectrum成像系统 | Caliper Life Sciences | -- |
| PET成像 | HM-20医用回旋加速器 | Sumitomo | -- |
| Super-Nova® PET扫描仪 | PINGSHENG | -- | |
| 蛋白定量 | Pierce™ BCA蛋白定量试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| 蛋白纯化 | Superdex 75 Increase 10/300 GL 柱 | Cytiva | -- |
| 10-kDa截留离心过滤装置 | Millipore | -- | |
| BLI | Octet RED96e | ForteBio Inc., Sartorius | -- |
| HER2/ERBB2蛋白 | Sino Biological | 10004-H02H | |
| 细胞转染 | 聚乙烯亚胺 | Polysciences | 23966 |
| 免疫荧光 | 抗PSMA抗体 | Abcam | ab19071; |
| FITC标记的二抗 | ZSGB-Bio | ZF-0312 | |
| 生化检测 | AST活性检测试剂盒 | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | -- |
| ALT活性检测试剂盒 | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| ncAA合成 | 合成pTAF和mTAF的化学反应条件，包括反应温度、时间、催化剂和纯化方法 阅读提示：Methods中“4-azidobutanenitrile (2)”、“(S)-3-(4-(6-(3-azidopropyl)-1,2,4,5-tetrazin-3-yl) phenyl)-2-((tert-butoxycarbonyl) amino) propanoic acid (4, Boc-pTAF)”等小节 |
| 遗传编码 | pTAFRS和R2-74RS突变体序列，ncAA浓度，诱导条件（IPTG浓度、温度、时间），表达宿主菌株 阅读提示：Methods中“Proteins expression and SDS–PAGE analysis”小节及“General plasmid construction” |
| 蛋白偶联反应 | 反应缓冲液、pH、温度、时间、试剂浓度和摩尔比 阅读提示：Methods中“Antibody fragments conjugation”小节 |
| 体内成像 | 肿瘤细胞系、接种细胞数和基质胶，小鼠品系、性别、周龄，注射剂量和体积，成像时间点 阅读提示：Methods中“In vivo fluorescence imaging of mice bearing 22Rv1 prostate tumors”和“In vivo fluorescence imaging of BALB/c nude mice bearing HCC1954 tumors” |
| 细胞活力实验 | 细胞密度、药物浓度梯度、孵育时间、MTT浓度及检测波长 阅读提示：Methods中“Cell viability assay” |
| 放射性标记 | 放射性核素活度、标记缓冲液、反应时间、纯化方法、放射化学纯度 阅读提示：Methods中“64Cu labeling” |