A genetically engineered, stem-cell-derived cellular vaccine.
包括体外细胞工程和功能验证（CRISPR编辑、NK杀伤、凋亡检测）、小鼠体内安全性检测（无致瘤性）以及非人灵长类免疫原性和攻毒保护实验，实验完整度高。
人类诱导多能干细胞（iPSC）工程化的通用疫苗细胞（UVC） 恒河猴（Macaca mulatta）模型 食蟹猴（Macaca fascicularis）模型 C57BL/6J小鼠（用于安全性评估）
UVC疫苗剂量（107或108细胞） 免疫途径（肌内注射，无佐剂） 免疫时间表（初次免疫和加强免疫的时间点） 攻毒方式（异源Delta变异株，鼻内和气管内，剂量1.0×10^5 TCID50） 中和抗体和病毒载量检测（假病毒中和实验和sgRNA RT-PCR）
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
通过CRISPR基因编辑构建稳定表达SARS-CoV-2刺突蛋白、敲除MHC-I并表达MICA的iPSC细胞系，以模拟病毒感染细胞的特征。
使用CRISPR-Cas9在iPSC的AAVS1位点整合刺突基因，在ROSA位点整合MICA表达框，并敲除B2M基因。通过流式细胞术、Western blot和ELISA验证刺突蛋白表达和抗原释放。通过7-AAD染色、细胞活力、集落形成和体内致瘤性实验评估凋亡和安全性。
评估MHC-I缺失和MICA表达对NK细胞活化和杀伤UVC的影响。
将人类和食蟹猴NK细胞与UVC共培养，进行细胞毒性实验和细胞内细胞因子染色（ICS），检测CD107a、MIP-1β、IFN-γ、TNF-α等。比较MHC-I敲除和瞬时/稳定表达NKG2D配体的效果。
评估UVC在猕猴中诱导中和抗体和特异性抗体的能力。
用不同剂量（107和108）的UVC免疫食蟹猴，初免后6周加强，在多个时间点采血，通过假病毒中和实验和ELISA检测中和抗体、RBD和刺突特异性抗体。
评估UVC疫苗对异源Delta变异株的保护效果。
用108 UVC免疫恒河猴，在初次免疫后4周加强，再过2周后进行异源Delta变异株攻毒。通过RT-PCR检测BAL和鼻拭子中的亚基因组RNA水平。
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | 玻璃粘连蛋白 | StemCell Technologies | 100-0763 |
| mTeSR Plus培养基 | -- | -- | |
| Rock抑制剂 | StemCell Technologies | -- | |
| G418 | Sigma-Aldrich | 4727878001 | |
| 嘌呤霉素 | Sigma-Aldrich | P9620 | |
| Accutase | StemCell Technologies | 07920_C | |
| CryoStor-CS10冷冻液 | StemCell Technologies | 07930_C | |
| CellDrop细胞计数器 | De-Novix | -- | |
| CRISPR工程 | Cas9蛋白 | IDT | 1081066 |
| Neon电转仪 | Lonza | -- | |
| Buffer P3 | Lonza | -- | |
| DirectPCR裂解液 | Viagen Biotech | -- | |
| 蛋白酶K | Promega | MC5005 | |
| GoTaq G2 PCR预混液 | Promega | M7823 | |
| QIAquick PCR纯化试剂盒 | Qiagen | 28104 | |
| 蛋白检测 | RIPA裂解液 | ThermoFisher | 89900 |
| 蛋白酶抑制剂混合物 | Sigma | P8340 | |
| BCA蛋白定量试剂盒 | ThermoFisher | 23225 | |
| Western blot | LDS上样缓冲液 | ThermoFisher | NP0007 |
| Mini-PROTEAN TGX预制胶4-15% | Bio-Rad | 4561083 | |
| PVDF膜 | -- | -- | |
| Super-Signal West Femto试剂盒 | ThermoFisher | 34094 | |
| ELISA | COVID-19 S蛋白ELISA试剂盒 | Abcam | ab284402 |
| 细胞提取缓冲液 | Invitrogen | FNN0011 | |
| 细胞凋亡/增殖检测 | FITC Annexin V凋亡检测试剂盒（含7-AAD） | Biolegend | 640922 |
| CellTrace Yellow增殖染料 | Molecular Probes | -- | |
| 结晶紫 | Thermo Scientific | 212121000 | |
| NK杀伤实验 | 钙黄绿素乙酰氧基甲酯（CAM） | Invitrogen | C3099 |
| CD3细胞去除试剂盒 | Miltenyi Biotec | 130-050-101 | |
| RPMI 1640培养基（含Glutamax） | Life Technologies | -- | |
| IL-2 | -- | -- | |
| IL-15 | -- | -- | |
| 细胞转染 | 原代细胞4D核转染试剂盒 | Lonza | V4XP-3024 |
| EGM2培养基 | Lonza | -- | |
| VEG-F蛋白 | Peprotech | 100-20 | |
| 流式细胞术 | Live/Dead可固定死细胞染料 | Invitrogen | L23101 |
| Fortessa流式细胞仪 | BD Bioscience | -- | |
| FlowJo 10软件 | BD Biosciences | -- | |
| 免疫组织化学 | Hamamatsu切片扫描仪 | Hamamatsu | -- |
| RNA提取和RT-qPCR | ReliaPrep RNA小提试剂盒 | Promega | Z6010 |
| High-Capacity cDNA逆转录试剂盒 | Applied Biosystems | 4368814 | |
| Brilliant III Ultra-Fast SYBR Green qPCR预混液 | Agilent Technologies | 600882 | |
| CFX Opus实时荧光定量PCR仪 | Bio-Rad | -- | |
| Nanodrop One分光光度计 | ThermoFisher | -- | |
| 病毒载量检测 | AmpliCap-Max T7高产量mRNA合成试剂盒 | Cellscript | C-ACM04037 |
| Superscript III VILO逆转录酶 | Invitrogen | 11754050 | |
| QuantStudio 6和7 Flex实时PCR系统 | Applied Biosystems | -- | |
| 血清抗体ELISA | KPL TMB SureBlue底物液 | SeraCare | 5120-0075 |
| KPL TMB终止液 | SeraCare | 5150-0022 | |
| 抗猕猴IgG HRP | NIH NHP Reagent Program | 1b3-HRP: | |
| 假病毒中和实验 | psPAX2包装质粒 | AIDS Resource and Reagent Program | 11348 |
| pLenti-CMV Puro-Luc荧光素酶质粒 | Addgene | 17477 | |
| Steady-Glo荧光素酶检测试剂盒 | Promega | E2510 | |
| 抗体 | 兔抗SARS-CoV-2刺突糖蛋白S1抗体 | Abcam | ab275759 |
| 山羊抗兔IgG H&L Alexa 488 | Abcam | ab150077 | |
| 小鼠抗人MICA/MICB PE | Biolegend | 320906 | |
| 小鼠抗人HLA-A,B,C Alexa 647 | Biolegend | 311416 | |
| 兔抗SARS-CoV-2抗体 | Sino Biological | 40591-T62 | |
| 小鼠抗人β-肌动蛋白抗体 | Abcam | ab8226 | |
| 山羊抗兔HRP | Sino Biological | SSA003 | |
| 小鼠抗人ULBP-1抗体 | R & D Systems | MAB1380 | |
| 小鼠抗人CD107a抗体 | BD Biosciences | 561343 | |
| 小鼠抗人CD3 BV421 | BD Biosciences | 562877 | |
| 小鼠抗人CD14 BV650 | BD Biosciences | 563420 | |
| 小鼠抗人CD16 BV496 | BD Biosciences | 612945 | |
| 小鼠抗人CD20 BV570 | BD Biosciences | 741210 | |
| 小鼠抗人CD56 BV605 | BD Biosciences | 742659 | |
| 小鼠抗人HLA-DR APC-H7 | BD Biosciences | 561358 | |
| 小鼠抗人NKG2A PE-Cy7 | Beckman Coulter | B10246 | |
| 小鼠抗人MIP-1β FITC | BD Biosciences | 560565 | |
| 小鼠抗人IFN-γ BV395 | BD Biosciences | 563563 | |
| 小鼠抗人TNF-α BV650 | BD Biosciences | 563418 | |
| 其他 | 白细胞激活混合物 | BD Biosciences | 550583 |
| 人热灭活AB血清 | Sigma | H3667 |
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| UVC细胞培养和基因工程 | 细胞系来源、培养基组成、培养条件、CRISPR编辑靶点和转染方法 阅读提示：STAR★Methods：Cell lines、CRISPR genetic engineering |
| NK细胞杀伤实验 | NK细胞来源、富集方法、效靶比、孵育时间、检测指标 阅读提示：STAR★Methods：CAM cytotoxicity assay、NK cell intracellular cytokine staining assay |
| 非人灵长类免疫实验 | 动物种属、年龄、免疫剂量、免疫途径、免疫时间表、检测方法和时间点 阅读提示：STAR★Methods：Animals and study design、Results 图3 |
| 攻毒保护实验 | 攻毒毒株、剂量、途径、病毒载量检测方法、采样时间点 阅读提示：STAR★Methods：Animals and study design、Results 图4 |
