构建角质形成细胞特异性IL-38敲除小鼠并鉴定
验证IL-38在角质形成细胞中的特异性缺失，并评估其对表皮屏障的影响。
将Il-38f/f小鼠与K14Cre/+小鼠杂交，获得K14Cre/+‐Il-38f/f小鼠，通过qPCR和western blot确认IL-38缺失，并进行皮肤屏障功能检测。
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白细胞介素-38以IL-1Rrp2依赖性方式促进皮肤肿瘤发生
Interleukin-38 promotes skin tumorigenesis in an IL-1Rrp2-dependent manner.
实验完整度
高该研究包含角质形成细胞特异性敲除小鼠模型、细胞系功能实验、蛋白互作与信号通路验证等多个独立实验层级，并进行了体内外功能验证。
主要模型
K14Cre/+‐Il‐38f/f（角质形成细胞特异性IL-38敲除）小鼠 DMBA/TPA诱导的皮肤鳞状细胞癌小鼠模型 A431人皮肤鳞状细胞癌细胞系 HEK293T细胞
重点核对
模型类型：DMBA/TPA诱导的皮肤肿瘤模型，DMBA单次给药（50 μg/200 μl丙酮），TPA每周两次给药（5 μg/200 μl丙酮），持续32周 动物品系：Il-38f/f（C57BL/6背景）和K14Cre/+‐Il-38f/f小鼠 细胞系：A431（人皮肤鳞状细胞癌）、HEK293T 关键处理：rIL-38（200 ng/ml）刺激，IL-38 shRNA，IL-1Rrp2 siRNA，JNK siRNA 主要检测终点：肿瘤数量、体积、恶性转化率、免疫细胞浸润（流式）、增殖（Ki67）
摘要
白细胞介素-38（IL-38）与慢性炎症性疾病密切相关；然而，其在肿瘤发生中的作用尚不清楚。我们证明了IL-38（在皮肤中高表达）在人皮肤鳞状细胞癌以及7,12-二甲基苯并蒽/12-O-十四烷酰佛波醇-13-乙酸酯诱导的小鼠皮肤肿瘤发生中表达下调。角质形成细胞特异性敲除IL-38的小鼠表现出皮肤肿瘤形成和恶性进展受到抑制。角质形成细胞特异性缺失IL-38与炎性细胞因子表达减少相关，导致局部肿瘤微环境中髓系细胞浸润减少。IL-38对于表皮突变不是必需的，但角质形成细胞特异性缺失IL-38会减少增殖基因表达以及表皮细胞增殖和增生。在机制上，我们首次证明IL-38以IL-1受体相关蛋白2（IL-1Rrp2）依赖性方式激活c-Jun N末端激酶（JNK）/激活蛋白1信号转导通路，从而促进肿瘤细胞中癌症相关炎性细胞因子的表达以及增殖和迁移。我们的发现强调了IL-38通过IL-1Rrp2/JNK调节表皮细胞增生和促肿瘤微环境的作用，并提示IL-38/IL-1Rrp2可作为皮肤癌的预防和潜在治疗靶点。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- IL-38在皮肤肿瘤发生中的作用及其分子机制是什么？
- 核心机制
- IL-38通过与IL-1Rrp2结合，以IL-1Rrp2依赖性方式激活JNK/AP-1信号通路，促进癌症相关炎性细胞因子表达以及肿瘤细胞增殖和迁移。
- 主要证据
- 角质形成细胞特异性IL-38敲除小鼠在DMBA/TPA模型中肿瘤数量和体积减少，恶性进展降低；体内外实验表明IL-38敲除减少炎症细胞浸润和细胞因子表达；细胞实验证明IL-38通过IL-1Rrp2/JNK通路诱导炎症因子和增殖迁移。
- 研究意义
- 该研究揭示IL-38通过IL-1Rrp2/JNK通路调节表皮细胞增生和促肿瘤微环境，提示IL-38/IL-1Rrp2可作为皮肤癌的预防和潜在治疗靶点。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
DMBA/TPA诱导皮肤肿瘤模型
评估IL-38缺失对化学诱导皮肤肿瘤发生和进展的影响。
对K14Cre/+‐Il-38f/f和Il-38f/f小鼠进行DMBA/TPA处理，观察肿瘤发生、数量和体积，并分析恶性转化。
检测DNA损伤和Hras突变
确定IL-38缺失是否影响DMBA引起的突变频率。
通过γH2AX免疫组化和Hras密码子61突变特异性PCR检测DNA损伤和突变。
分析皮肤免疫细胞浸润和炎症因子表达
研究IL-38缺失对肿瘤微环境中免疫细胞浸润和炎症因子表达的影响。
通过流式细胞术分析皮肤免疫细胞亚群，并用qPCR检测炎症因子和趋化因子表达。
体外验证IL-38对肿瘤细胞增殖和迁移的影响
验证IL-38对皮肤癌细胞增殖、克隆形成和迁移的促进作用。
在A431细胞中过表达或敲低IL-38，通过细胞增殖检测、克隆形成实验和划痕实验评估细胞行为。
验证IL-38与IL-1Rrp2的结合及对JNK/AP-1通路的激活
确定IL-38的受体并结合机制，以及其对JNK/AP-1信号通路的激活作用。
通过pull-down实验检测IL-38与IL-1Rrp2-Fc等融合蛋白的结合，在293T细胞中过表达IL-1Rrp2及其突变体，检测JNK磷酸化和AP-1报告基因活性。
验证IL-38通过IL-1Rrp2/JNK途径促进细胞因子表达和细胞增殖迁移
证实IL-38的效应依赖于IL-1Rrp2和JNK。
在A431细胞中敲低IL-1Rrp2或JNK，观察IL-38过表达或敲低对炎症因子表达和细胞增殖迁移的影响。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 动物基因型鉴定 | 小鼠直接PCR试剂盒 | Bimake | -- |
| 细胞培养 | 杜氏改良Eagle培养基 | Gibco | -- |
| 胎牛血清 | Gibco | -- | |
| 青霉素-链霉素 | Gibco | -- | |
| DMBA/TPA皮肤癌模型 | 12-O-十四烷酰佛波醇-13-乙酸酯 | Sigma-Aldrich | -- |
| RNA提取 | TRIzol试剂 | ThermoFisher Scientific | -- |
| 反转录PCR | PrimeScript逆转录试剂盒（含gDNA Eraser） | Takara | -- |
| 定量PCR | TB Green™ Premix Ex Taq™ II | Takara | -- |
| 蛋白质印迹 | SDS-PAGE凝胶 | Beyotime Institute of Biotechnology | -- |
| PVDF膜 | Merck Millipore | -- | |
| 抗人IL-38抗体 | Abcam | ab180898 | |
| 抗小鼠IL-38抗体 | R&D Systems | MAB7774 | |
| 抗IL-18抗体 | Abcam | ab71495 | |
| 抗β-肌动蛋白抗体 | CST | 4970 | |
| 抗JNK抗体 | CST | 9252 | |
| 抗磷酸化JNK抗体 | CST | 4668 | |
| 抗细胞周期蛋白E抗体 | CST | 20808 | |
| 抗细胞周期蛋白A抗体 | R&D Systems | AF5999 | |
| 抗HA抗体 | CST | 3724 | |
| 抗人IL-1Rrp2抗体 | R&D Systems | AF872 | |
| 抗小鼠IL-1Rrp2抗体 | LSBio | LS-B10135 | |
| 抗IL-1RAPL1抗体 | R&D Systems | MAB975 | |
| 抗IL-1RAcp抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-376872 | |
| IgG-Fc融合蛋白 | Sino Biological | SSA001 | |
| HRP偶联二抗 | Invitrogen | A27036 | |
| HRP偶联二抗 | ZSGB-BIO | -- | |
| ECL化学发光试剂 | Merck Millipore | WBKLS0500 | |
| ELISA | 人IL-38/IL-1F10 ELISA试剂盒 | Neobioscience | -- |
| 免疫组织化学 | 抗γH2AX抗体 | Invitrogen | PA5-77995 |
| 抗人IL-18抗体 | Abcam | ab243091 | |
| 抗小鼠IL-18抗体 | Abcam | ab71495 | |
| DAB显色试剂盒 | ZSGB-BIO | ZLI-9017 | |
| 免疫荧光 | 抗IL-38抗体 | Abcam | ab180898 |
| 兔IgG | Abcam | ab37415 | |
| 抗角蛋白8抗体 | Abcam | ab53280 | |
| 抗Ki67抗体 | Abcam | ab16667 | |
| TRITC偶联驴抗兔抗体 | Invitrogen | A16040 | |
| DAPI染料 | Sigma-Aldrich | D9542 | |
| 皮肤屏障功能分析 | GPSkin蒸发仪 | GPOWER | -- |
| DNA提取 | TIANamp基因组DNA试剂盒 | Qiagen | -- |
| DNA定量 | NanoDrop-2000分光光度计 | Thermo Scientific | -- |
| Hras突变检测 | Premix Ex Taq™ | Takara | -- |
| 流式细胞术 | Liberase酶 | Roche | -- |
| 脱氧核糖核酸酶 | Roche | -- | |
| gentleMACS组织解离器 | Miltenyi Biotech | -- | |
| NovoCyte流式细胞仪 | ACEA Biosciences | -- | |
| CD11B-APC抗体 | eBioscience | 17-0112-82 | |
| MHC II-FITC抗体 | eBioscience | 11-5322-81 | |
| CD64-PE/Cyanine7抗体 | BioLegend | 139314 | |
| Ly6C-APC/Fire™ 750抗体 | BioLegend | 108456 | |
| MerTk-PE抗体 | BioLegend | 151506 | |
| CD207-PE抗体 | BioLegend | 144204 | |
| CD3-APC/Cyanine7抗体 | BioLegend | 100222 | |
| CD4-PE抗体 | BioLegend | 100408 | |
| pull-down实验 | 人IL-1Rrp2-Fc融合蛋白 | R&D Systems | -- |
| 人IL-1RAcp-Fc融合蛋白 | Sino Biological | -- | |
| 人IL-1RAPL1-Fc融合蛋白 | Sino Biological | -- | |
| 人IgG-Fc融合蛋白 | Sino Biological | -- | |
| IL-38重组蛋白 | Adipogen | -- | |
| Pierce蛋白A/G磁性微珠 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 荧光素酶报告基因 | AP-1荧光素酶报告基因 | Promega | -- |
| pRL-TK载体 | YouBio | -- | |
| X-tremeGENE™ HP DNA转染试剂 | Roche | -- | |
| 双荧光素酶报告基因检测系统 | Promega | -- | |
| 基因沉默 | IL-1Rrp2 siRNA | Dharmacon | -- |
| DharmaFECT转染试剂 | -- | -- | |
| JNK siRNA | CST | -- | |
| Lipofectamine™ RNAiMAX转染试剂 | Invitrogen | -- | |
| shRNA慢病毒 | Shanghai GenePharma Co., Ltd. | -- | |
| 嘌呤霉素 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 质粒转染 | pcDNA3.1-IL-38质粒 | Genewiz | -- |
| pCMV3-IL-1Rrp2-HA质粒 | Genewiz | -- | |
| pCMV3-IL-1Rrp2 ΔEx-HA质粒 | Genewiz | -- | |
| pCMV3-IL-1Rrp2 ΔTIR-HA质粒 | Genewiz | -- | |
| G418抗生素 | Gibco | -- | |
| 潮霉素B | Sigma-Aldrich | -- | |
| 细胞增殖检测 | CellTiter 96® AQueous One Solution细胞增殖检测试剂 | Promega | -- |
| 克隆形成实验 | 胰蛋白酶 | Gibco | -- |
| 结晶紫染色液 | Beyotime | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 动物模型构建 | 小鼠品系：Il-38f/f（C57BL/6背景）和K14Cre/+小鼠；基因型鉴定方法 阅读提示：Materials and Methods: Animals |
| DMBA/TPA处理 | DMBA剂量（50 μg/200 μl丙酮）、TPA剂量（5 μg/200 μl丙酮）、给药频率（每周两次）、持续时长（32周） 阅读提示：Materials and Methods: DMBA/TPA skin cancer model |
| 细胞培养与处理 | 细胞系来源（ATCC）、培养条件（DMEM+10% FBS）、IL-38刺激浓度（200 ng/ml）、siRNA/shRNA转染条件 阅读提示：Materials and Methods: Cell lines, siRNA and shRNA mediated silencing, Cell proliferation assay |
| 免疫细胞分析 | 皮肤消化条件（Liberase、DNase）、流式抗体组合、分析时间点（DMBA/TPA处理3周） 阅读提示：Materials and Methods: Isolation of DMBA/TPA-treated skin cells, Flow cytometry |
| 蛋白互作与信号通路 | pull-down条件（融合蛋白浓度、孵育时间）、JNK磷酸化检测时间点（15分钟）、IL-1Rrp2突变体构建 阅读提示：Materials and Methods: Pull-down assays, Western blotting; Figure 5 |