脂肪组织MDM2表达与营养状态关联分析
评估MDM2在脂肪组织中的表达是否受饮食和分化影响。
通过Western blot检测正常饮食和高脂饮食小鼠脂肪组织中MDM2蛋白水平；通过分化实验检测MDM2在脂肪细胞分化过程中的表达变化。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
鼠双微体2通过泛素介导的前列腺六跨膜上皮抗原4降解加重脂肪组织功能障碍
Murine double minute 2 aggravates adipose tissue dysfunction through ubiquitin-mediated six-transmembrane epithelial antigen of prostate 4 degradation.
实验完整度
高包含细胞实验、小鼠模型（Mdm2-AKI）、蛋白质组学/泛素组学、功能验证和回补实验，且明确验证了MDM2-STEAP4泛素化机制。
主要模型
小鼠附睾白色脂肪组织（eWAT） Mdm2脂肪细胞特异性敲入小鼠（Mdm2-AKI） 293T细胞 基质血管成分细胞（SVF）分化的脂肪细胞
重点核对
小鼠品系：Mdm2-AKI与WT，8周龄雄性 饮食条件：正常饮食（9%脂肪）或高脂饮食（60%脂肪） 干预方式：AAV9-STEAP4注射入eWAT，每侧3个位点，每点5μL（1.7×10^9 v.g/μL） 检测指标：体重、能量消耗、GTT/ITT、eWAT衰老/凋亡/炎症、肝脂质沉积 统计方法：重复测量双因素ANOVA、Student's t检验、单因素ANOVA等
摘要
健康的脂肪组织对于维持正常的能量稳态至关重要。关于鼠双微体2（MDM2）——一种E3泛素连接酶，在肿瘤病理学中备受关注——在脂肪组织中的作用知之甚少。我们的结果表明，MDM2的表达与营养状态相关。Mdm2脂肪细胞特异性敲入（Mdm2-AKI）小鼠表现出体重增加加剧、胰岛素抵抗和能量消耗减少。同时，长期高脂饮食（HFD）暴露导致Mdm2-AKI小鼠附睾白色脂肪组织（eWAT）功能障碍明显，如衰老、凋亡和慢性炎症，从而引发肝脂肪变性。机制上，MDM2可与前列腺六跨膜上皮抗原4（STEAP4）相互作用，并通过泛素介导的STEAP4降解抑制STEAP4表达。其中，STEAP4的K18和K161位点被MDM2泛素化修饰。最后，在HFD条件下，Mdm2-AKI小鼠eWAT中STEAP4的恢复挽救了MDM2诱导的脂肪功能障碍、胰岛素抵抗和肝脂肪变性。总之，eWAT中的MDM2-STEAP4轴在维持健康脂肪组织功能和改善肝脂肪变性中发挥重要作用。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- MDM2在脂肪组织中的作用及其机制，尤其是其如何影响脂肪组织功能和系统性代谢。
- 核心机制
- MDM2通过泛素-蛋白酶体途径降解STEAP4，降低其蛋白水平，从而加剧脂肪组织功能障碍。
- 主要证据
- 通过Mdm2-AKI小鼠模型，结合蛋白质组学和泛素组学鉴定STEAP4为MDM2底物；细胞实验证明MDM2促进STEAP4泛素化（K18和K161位点）；eWAT中恢复STEAP4可逆转MDM2诱导的脂肪功能障碍、胰岛素抵抗和肝脂肪变性。
- 研究意义
- 揭示MDM2-STEAP4轴在维持脂肪组织健康和改善肝脂肪变性中的关键作用，为代谢疾病治疗提供潜在靶点。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
构建Mdm2脂肪细胞特异性敲入小鼠并表型分析
探讨脂肪细胞MDM2过表达对能量代谢和胰岛素敏感性的影响。
通过CRISPR-Cas9构建Mdm2-AKI小鼠，并进行体重、食物摄入、能量消耗、GTT/ITT、组织重量及组织学分析。
高脂饮食下eWAT功能障碍检测
检测MDM2过表达是否加剧eWAT衰老、凋亡和炎症。
通过β-半乳糖苷酶染色、TUNEL染色、F4/80免疫组化、qPCR检测衰老、凋亡和炎症标志物。
肝脏表型分析
评估MDM2过表达对肝脏脂质积累和肝功能的影响。
测量肝脏重量、进行H&E和油红O染色，检测血清ALT、AST、TC、TG。
蛋白质组学和泛素组学分析
系统鉴定MDM2调控的蛋白和泛素化底物。
对eWAT进行LC-MS/MS蛋白质组学和泛素化肽段富集分析，比较Mdm2-AKI和WT小鼠的差异蛋白和泛素化位点。
STEAP4作为MDM2底物的验证
验证STEAP4是否被MDM2泛素化降解，并鉴定泛素化位点。
在293T细胞中共转染MDM2和STEAP4，进行体内泛素化实验和共免疫沉淀；构建STEAP4突变体（K18R、K97R、K161R）检测泛素化位点。
STEAP4回补实验
验证STEAP4恢复是否缓解MDM2诱导的代谢紊乱。
通过AAV9-STEAP4注射至Mdm2-AKI小鼠eWAT，随后进行HFD喂养，检测脂肪组织功能、胰岛素敏感性和肝脏表型。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 抗体 | 抗Perilipin A抗体 | Abclonal | A4758; |
| 抗β-肌动蛋白抗体 | Abclonal | AC026; | |
| 抗F4/80抗体 | Servicebio | GB11027; | |
| 抗MDM2抗体 | Abcam | ab38618; | |
| 抗STEAP4抗体 | Thermo Fisher Scientific | PA5-106509; | |
| 抗p53抗体 | Abclonal | A16989; | |
| 抗HA标签抗体 | Abclonal | AE036; | |
| 抗Flag抗体 | Abclonal | AE004; | |
| 抗Myc标签抗体 | Solarbio | K106458P; | |
| 抗GFP抗体 | Sigma-Aldrich | G1544; | |
| 抗PPARγ抗体 | Abclonal | A11183; | |
| 菌株 | Trans5α感受态细胞 | Transgen Biotech | CD201 |
| 病毒 | AAV9-CMV-mSteap4-MYC | Hanbio Biotechnology (shanghai) Co.,LTD | -- |
| 细胞培养 | 胎牛血清 | Gibco | 10091148 |
| 细胞处理 | 棕榈酸 | Sigma-Aldrich | P5585 |
| MG132 | MCE | 133407-82-6 | |
| RNA提取 | Trizol试剂 | Invitrogen | 15596018 |
| 蛋白提取 | cComplete蛋白酶抑制剂混合物 | Roche | 4693132001 |
| qPCR | SYBR Green PCR预混液 | Promega | A6002 |
| Western blot | 5×SDS上样缓冲液 | Beyotime Biotechnology | P0015 |
| 蛋白分子量标准 | Thermo Fisher Scientific | 26616 | |
| 细胞培养 | 胰岛素 | Sigma-Aldrich | I-5500 |
| 蛋白提取 | RIPA裂解液 | Beyotime Biotechnology | P0013 |
| 病毒转导 | 聚凝胺 | Millipore | ISEQ00010 |
| 基因分型 | Direct PCR裂解试剂（鼠尾） | Viagen Biotech | 102-T |
| 细胞培养 | DMEM高糖培养基 | Gibco | C11995500BT |
| DMEM/F12培养基 | Viva Cell | C3130 | |
| 蛋白提取 | Western和IP细胞裂解液 | Beyotime Biotechnology | P0013 |
| 原代细胞分离 | I型胶原酶 | Sigma-Aldrich | C0130 |
| 细胞分化 | 地塞米松 | Sigma-Aldrich | D4902 |
| 异丁基甲基黄嘌呤 | Sigma-Aldrich | I5879 | |
| 罗格列酮 | Sigma-Aldrich | R2408 | |
| 三碘甲状腺原氨酸 | Sigma-Aldrich | T2877 | |
| Western blot | ECL超敏化学发光底物 | Millipore | WBULS0500 |
| 蛋白定量 | BCA蛋白定量试剂盒 | CWBIO | CW0014S |
| 分子克隆 | 无缝克隆试剂盒 | clone smarter | C5891 |
| 衰老检测 | 衰老β-半乳糖苷酶染色试剂盒 | Beyotime Biotechnology | C0602 |
| cDNA合成 | 高容量cDNA逆转录试剂盒 | Applied Biosystems | 4368813 |
| 凋亡检测 | TUNEL染色试剂盒 | Servicebio | G1504/G1502 |
| 质粒提取 | 质粒小提试剂盒 | TIANGEN | DP103-03 |
| 无内毒素大提试剂盒 | TIANGEN | DP117 | |
| DNA纯化 | 凝胶DNA回收试剂盒 | Magen | D2111-02 |
| 细胞培养 | HEK293T细胞 | ATCC | CRL-3216 |
| 动物模型 | Mdm2脂肪细胞特异性敲入小鼠 | -- | -- |
| C57BL/6小鼠 | -- | -- | |
| 质粒 | pCMV3-Flag-mMDM2质粒 | Sino Biological | MG50533-NF |
| pCMV3-myc-mSTEAP4质粒 | Sino Biological | MG5A0592-NM | |
| pCMV3-myc-mSTEAP4(K18R)质粒 | -- | -- | |
| pCMV3-myc-mSTEAP4(K97R)质粒 | -- | -- | |
| pCMV3-myc-mSTEAP4(K161R)质粒 | -- | -- | |
| pEGFP-C1-STEAP4质粒 | -- | -- | |
| 动物饲料 | 小鼠高脂饲料 | Researsh Diet | D12492 |
| Western blot | PVDF膜 | Millipore | IPVH00010 |
| 免疫沉淀 | 抗DDDDK标签单抗磁珠琼脂糖 | MBL International | M185-10R |
| 抗Myc标签单抗磁珠琼脂糖 | Bimake | B26301 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 动物实验 | 小鼠周龄、性别（8周龄雄性）、饮食成分（NCD 9%脂肪、HFD 60%脂肪）、饲养环境（SPF）、注射方式（eWAT多点注射AAV9-STEAP4，每点5μL，1.7×10^9 v.g/μL） 阅读提示：Methods：Mice |
| 细胞实验 | 细胞类型（293T、SVF细胞）、培养条件（DMEM、10% FBS）、分化诱导剂浓度（胰岛素、地塞米松等）、处理和转染条件 阅读提示：Methods：Cell culture，Stromal-vascular fraction cells |
| 分子实验 | 抗体信息（来源、稀释比）、蛋白提取方法（RIPA裂解液、蛋白酶抑制剂）、免疫沉淀条件（抗体磁珠）、泛素化实验中MG132浓度和处理时间 阅读提示：Methods：Western blotting，Co-immunoprecipitation，In vitro ubiquitination assays |
| 代谢表型分析 | 代谢笼测量适应时间（24h）、GTT/ITT的空腹时间和注射剂量（葡萄糖1g/kg、胰岛素0.75IU/kg）、EchoMRI测量内容 阅读提示：Methods：Mouse calorimetry，Glucose tolerance test and insulin tolerance test，Mouse whole-body composition |