构建稳定表达sCD2v的CHO细胞系
获得能分泌表达CD2v胞外域蛋白的稳定细胞系，以制备具有正确糖基化的重组蛋白。
将编码CD2v信号肽和胞外域（带His标签）的基因克隆到pLVX-IRES-ZsGreen1载体，与psPAX2和pMD2.G共转染HEK293T细胞包装慢病毒，转导CHO-S细胞，通过流式分选ZsGreen1阳性单克隆，筛选高表达克隆并扩大培养。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
ASFV CD2v蛋白胞外域在哺乳动物细胞中的表达及B细胞表位的鉴定
Expression of extracellular domain of ASFV CD2v protein in mammalian cells and identification of B cell epitopes.
实验完整度
高研究包含体外表达纯化、免疫小鼠制备单抗、Western blot/IFA验证、肽扫描表位鉴定及保守性分析，形成多层级功能与机制验证。
主要模型
CHO-S细胞 HEK293T细胞 SP2/0骨髓瘤细胞 BALB/c小鼠
重点核对
CHO-S细胞稳定表达sCD2v的筛选（ZsGreen1阳性率>95%） sCD2v蛋白的糖基化状态（PNGase F处理前后分子量变化） 单克隆抗体的特异性（Western blot和IFA验证） 表位鉴定（P10-2: 128TCKKNNGTNT137和P12-1: 148VKYTNESILE157） 表位保守性（基因II型ASFV株中高度保守）
摘要
非洲猪瘟病毒（ASFV）是一种高致病性大DNA病毒，是全世界非洲猪瘟的病原。ASFV毒力基因EP402R编码CD2v，这是一种在ASFV感染过程中起重要作用的结构蛋白。本研究构建了稳定表达CD2v胞外区的CHO-S细胞系，并从细胞培养上清中纯化出分泌型CD2v（sCD2v）。纯化的糖基化sCD2v蛋白具有高免疫反应性和免疫原性。此外，我们发现糖基化对CD2v的免疫反应性有决定性影响。然后用sCD2v制备了五种CD2v特异性单克隆抗体。通过Western blot和间接免疫荧光试验（IFA）证实了所有单克隆抗体与CD2v蛋白的反应性。有趣的是，mAb 8D5与sCD2v的反应性取决于sCD2v的糖基化状态。随后使用一系列覆盖CD2v胞外域的重叠合成肽进行B细胞表位作图，鉴定了mAb 4B11的B细胞表位128TCKKNNGTNT137和mAbs 5H4和5F7的148VKYTNESILE157。由于这些mAb具有明确的表位，它们可能作为有价值的工具，用于ASFV CD2v结构-功能研究、诊断检测和控制ASFV传播的预防方法。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 本研究旨在表达ASFV CD2v蛋白的胞外域，并鉴定其B细胞表位，为CD2v功能研究和检测方法开发提供工具。
- 核心机制
- 糖基化对CD2v蛋白的免疫反应性具有决定性影响，糖基化的sCD2v与ASFV阳性猪血清的反应性远强于去糖基化形式。
- 主要证据
- 通过CHO-sCD2v细胞系表达并纯化sCD2v，Western blot和ELISA证实糖基化增强免疫反应性；制备的5种mAb中，4B11识别128TCKKNNGTNT137，5H4和5F7识别148VKYTNESILE157，经肽扫描和点印迹验证。
- 研究意义
- 三种具有明确表位的mAb可能作为ASFV CD2v结构-功能研究、诊断检测和预防方法的有价值工具，尤其针对中国流行的基因II型ASFV。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
sCD2v蛋白的纯化与糖基化分析
获得高纯度sCD2v蛋白并验证其糖基化状态。
CHO-sCD2v细胞培养9天后收集上清，经Ni-NTA亲和层析纯化，SDS-PAGE检测纯度；用PNGase F处理去除N-糖基化，比较处理前后分子量。
免疫小鼠制备单克隆抗体
获得特异性识别sCD2v的单克隆抗体。
用纯化的sCD2v免疫BALB/c小鼠，经三次加强免疫后，取脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合，经HAT/HT培养基筛选，间接ELISA检测阳性克隆，经亚克隆和腹水制备获得抗体。
单克隆抗体的特异性验证
验证所获mAb与CD2v蛋白的特异性结合。
通过IFA检测mAb与转染pTrip-CD2v的HEK293T细胞中全长CD2v的结合；通过Western blot检测mAb与sCD2v和去糖基化sCD2v的结合。
B细胞表位作图
定位mAb识别的线性B细胞表位。
设计覆盖CD2v胞外域的15个重叠肽，成功合成9个，与mAb进行肽ELISA和点印迹检测；进一步用截短肽P10-2和P12-1精确定位表位。
表位保守性分析
评估所鉴定的表位在不同ASFV株中的保守性。
使用Jalview软件对比9个中国流行株和28个全球代表株的CD2v序列。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | SMM CHO-SI表达培养基 | Beijing Sino Biological Co. | M293II |
| DMEM培养基 | Solarbio | -- | |
| 胎牛血清 | Gibco-BRL | -- | |
| 转染 | jetPRIME®转染试剂 | Polyplus-transfection® SA | -- |
| 流式分选 | AriaTM Ⅲ流式细胞仪 | BD Biosciences | -- |
| 蛋白纯化 | Ni-NTA亲和层析 | -- | -- |
| 蛋白定量 | BCA蛋白定量试剂盒 | Solarbio | -- |
| 糖基化分析 | 肽N-糖苷酶F | Yeasen, Co., Ltd. | -- |
| 免疫 | 完全弗氏佐剂 | Sigma-Aldrich | -- |
| 不完全弗氏佐剂 | Sigma-Aldrich | -- | |
| 杂交瘤筛选 | 聚乙二醇1500 | -- | -- |
| RPMI 1640培养基 | -- | -- | |
| ELISA | MaxiSorp 96孔板 | Thermo Fisher Scientific Inc. | -- |
| HRP标记山羊抗小鼠/猪IgG | -- | -- | |
| TMB底物 | -- | -- | |
| 酶标仪 | Bio-Rad | -- | |
| Western blot | PVDF膜 | -- | -- |
| ECL Western blot检测系统 | -- | -- | |
| IFA | FITC标记山羊抗小鼠IgG | -- | -- |
| DAPI | Solarbio | -- | |
| 表位鉴定 | 重叠肽 | GL Biochem | -- |
| 硝酸纤维素膜 | Schleicher & Schuell, Inc. | AE99 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 构建稳定细胞系 | 慢病毒包装和转导条件、筛选时间、ZsGreen1阳性率 阅读提示：Materials and methods 2.3, Results 3.1 |
| 蛋白纯化与糖基化分析 | 培养时间（9天）、PNGase F处理量（10 μg蛋白+2 μl酶）和温度时间 阅读提示：Materials and methods 2.4, 2.5, Results 3.2 |
| 单克隆抗体制备 | 免疫剂量和佐剂、免疫周期、融合方法（PEG 1500）、筛选方法（间接ELISA） 阅读提示：Materials and methods 2.6, Results 3.3 |
| 抗体特异性验证 | IFA中用pTrip-CD2v转染HEK293T细胞的培养时间（48小时）、mAb稀释度；Western blot中sCD2v和去糖基化sCD2v的处理 阅读提示：Materials and methods 2.8, 2.9, Results 3.3 |
| 表位鉴定 | 肽合成质量（≥95%）、肽-BSA偶联方法（戊二醛法）、mAb腹水稀释度（ELISA 1:5,000, dot 1:2,000） 阅读提示：Materials and methods 2.10, Results 3.4 |