纳米抗体的筛选与鉴定
从免疫羊驼中筛选出能结合SARS-CoV-2 spike并与SARS-CoV-2和SARS-CoV-1交叉中和的纳米抗体。
通过MACS和FACS分选富集特异性VHH克隆，共鉴定593个结合纳米抗体，其中124个具有中和活性，91个交叉中和SARS-CoV-1。
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针对SARS-CoV-2 Omicron亚型BA.1、BA.2和BA.4/5及多种沙贝病毒具有广泛中和和保护作用的纳米抗体
Broadly neutralizing and protective nanobodies against SARS-CoV-2 Omicron subvariants BA.1, BA.2, and BA.4/5 and diverse sarbecoviruses.
实验完整度
高包含体外假病毒中和、活病毒中和、晶体结构、冷冻电镜、生化机制验证及K18-hACE2小鼠体内保护实验等多个独立证据层级。
主要模型
免疫羊驼来源的VHH纳米抗体库 K18-hACE2转基因小鼠感染模型 HEK293T细胞 Vero E6细胞
重点核对
纳米抗体3-2A2-4的IC50值（如对WT D614G为0.043 μg/mL，对BA.1为0.032 μg/mL） 小鼠实验中3-2A2-4的给药剂量（10 mg/kg体重，腹腔注射） 小鼠攻击剂量（Omicron: 1.7×10^3 PFU; Delta: 10^3 PFU，鼻内接种） 小鼠品系和性别（8周龄雌性K18-hACE2转基因小鼠） 活病毒中和试验使用的细胞系（Vero E6细胞）
摘要
随着SARS-CoV-2 Omicron和其他关切变异株（VOCs）在全球持续传播，开发具有广泛和保护活性的抗体和疫苗是全球优先事项。在此，我们报道了从免疫羊驼中鉴定出一组特殊的纳米抗体，对包括Omicron亚型BA.1、BA.2和BA.4/5、SARS-CoV-1以及主要沙贝病毒在内的多种VOCs具有效力。一个代表性纳米抗体3-2A2-4的晶体结构分析发现了一个高度保守的表位，位于受体结合域（RBD）的隐蔽面和外表面之间，与受体ACE2结合位点不同。冷冻电镜和生化评估揭示，3-2A2-4干扰RBD与ACE2结合所需的结构改变。被动递送3-2A2-4可保护K18-hACE2小鼠免受真实SARS-CoV-2 Delta和Omicron的感染。这些独特纳米抗体的鉴定将为下一代抗体疗法和泛沙贝病毒疫苗的设计提供信息。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 是否能够从免疫羊驼中鉴定出针对SARS-CoV-2 Omicron亚型及其他沙贝病毒具有广谱中和活性和保护性的纳米抗体？
- 核心机制
- 3-2A2-4通过结合RBD上的高度保守表位，抑制RBD从'下'到'上'构象的转变，从而阻断ACE2结合和病毒进入。
- 主要证据
- 通过假病毒和活病毒中和实验测定IC50，晶体结构和冷冻电镜解析表位及构象变化，并在K18-hACE2小鼠模型中通过被动递送3-2A2-4验证了预防Delta和Omicron感染的保护效果。
- 研究意义
- 鉴定的纳米抗体和保守表位为开发针对多种沙贝病毒的下一代抗体疗法和疫苗提供了重要参考。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
纳米抗体的广谱中和活性评估
评估纳米抗体对包括Omicron亚型和多种沙贝病毒在内的假病毒和活病毒的中和活性。
使用假病毒中和试验和活病毒FRNT测定IC50，并比较不同纳米抗体对19种病毒的活性。
纳米抗体表位和机制的解析
确定纳米抗体的结合表位和中和机制。
通过晶体结构、冷冻电镜和生化实验分析纳米抗体与RBD的结合模式和机制。
体内保护效果评估
评估3-2A2-4对K18-hACE2小鼠感染真实Delta和Omicron的保护效果。
小鼠在感染前24小时腹腔注射3-2A2-4 (10 mg/kg)，随后鼻内攻击，监测生存率、体重、肺病毒载量和组织病理。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | -- | -- |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| 青霉素-链霉素 | -- | -- | |
| FreeStyle 293F培养基 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 蛋白表达与纯化 | Strep-Tactin琼脂糖 | IBA Lifesciences | 2-1201-025 |
| Ni-NTA树脂 | QIAGEN | 30230 | |
| Bac-to-Bac杆状病毒表达系统 | Thermo Fisher Scientific | 10359016 | |
| 酵母展示 | pYD1载体 | -- | -- |
| HA标签(6E2)小鼠单克隆抗体Alexa Fluor 488偶联物 | Cell Signaling | 2350S | |
| 链霉亲和素-PE | eBioscience | 12-4317-87 | |
| 重组蛋白表达 | 聚乙烯亚胺 | Polysciences | 23966 |
| 蛋白纯化 | AmMag蛋白A磁珠 | Genscript | L00695 |
| Superdex 200高性能柱 | GE Healthcare | -- | |
| Nanodrop 2000分光光度计 | Thermo Scientific | -- | |
| 假病毒中和试验 | Bright-Glo荧光素酶检测系统 | Promega | E2650 |
| 活病毒中和试验 | 兔抗SARS-CoV-N IgG | SinoBiological | 40588-T62 |
| HRP标记山羊抗兔IgG（重链+轻链） | TransGen Biotech | HS101-01 | |
| KPL TrueBlue过氧化物酶底物 | Seracare Life Sciences | 5510-0030 | |
| SPR分析 | CM5传感芯片 | Cytiva | BR100530 |
| Western blot | 胰蛋白酶 | Thermo Fisher Scientific | 27250018 |
| 蛋白酶K | Thermo Fisher Scientific | AM2546 | |
| 4-12%梯度Tris-MOPS凝胶 | GenScript | M00653 | |
| 抗SARS-CoV-2 S2多克隆抗体 | SinoBiological | T40590-T62 | |
| HRP标记抗兔二抗 | Promega | W4011 | |
| 细胞表面染色 | 抗His标签-PE | Miltenyi Biotec | 130-120-787 |
| 链霉亲和素-APC | eBioscience | 17-4317-82 | |
| 抗人IgG Fc-PE | Biolegend | 410708 | |
| 晶体学 | 硫酸铵 | -- | -- |
| Bis-Tris | -- | -- | |
| 聚乙二醇3350 | -- | -- | |
| DL-苹果酸 | -- | -- | |
| 甲酸铵 | -- | -- | |
| 冷冻电镜 | Quantifoil铜网（300目，R1.2/1.3） | -- | -- |
| FEI Vitrobot | FEI | -- | |
| FEI Titan Krios显微镜 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| Gatan K3 Summit直接电子探测器 | Gatan Inc. | -- | |
| 动物实验 | K18-hACE2转基因小鼠 | InVivos Ptd Ltd | -- |
| 兔抗SARS-CoV-2 N蛋白单克隆抗体 | Abcam | ab271180 | |
| DAB溶液 | Abcam | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 纳米抗体筛选 | 免疫方案（抗原种类、剂量、佐剂、次数）、酵母展示文库构建方法、FACS分选条件 阅读提示：Methods：'Immunization of alpaca, construction of yeast display VHH library, and isolation of VHH yeasts specific for SARS-CoV-2 and SARS-CoV-1 spikes' |
| 假病毒中和试验 | 细胞系（HeLa-ACE2）、病毒构建（spike突变）、纳米抗体稀释系列、孵育时间和温度 阅读提示：Methods：'Production of SARS-CoV-2 and sarbecovirus pseudoviruses'和'Neutralization activity of nanobodies against pseudoviruses and live SARS-CoV-2' |
| 活病毒中和试验 | 病毒株（WT, Alpha, Beta, Delta, Omicron BA.1）、细胞系（Vero E6）、纳米抗体稀释系列、孵育时间和温度 阅读提示：Methods：'Neutralization activity of nanobodies against pseudoviruses and live SARS-CoV-2' |
| 晶体结构解析 | 蛋白浓度、结晶条件（沉淀剂、pH）、衍射数据收集波长和光束线 阅读提示：Methods：'Crystallization and data collection'和表S2 |
| 冷冻电镜分析 | 蛋白浓度、摩尔比、孵育时间、网格类型、电镜参数 阅读提示：Methods：'Cryo-EM sample preparation and data collection'和'Cryo-EM data processing' |
| 体内保护实验 | 小鼠品系、年龄、性别、给药剂量和途径、攻毒剂量和途径、观察时间、终点标准 阅读提示：Methods：'Nanobody protection against authentic SARS-CoV-2 infection in K18-hACE2 mice' |