构建表达载体与融合蛋白表达纯化
获得具有正确结构的可溶性NK-CAR蛋白（MS-Ig）及对照蛋白（MS）。
合成MS-Ig基因并克隆入pFlag-CMV5.1载体，转染悬浮HEK293细胞表达，通过SPA柱纯化MS-Ig，通过Ni亲和层析纯化MS。
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可溶性NK-CAR介导NK细胞对靶CD20+淋巴瘤细胞的特异性细胞毒性
A Soluble NK-CAR Mediates the Specific Cytotoxicity of NK Cells toward the Target CD20+ Lymphoma Cells.
实验完整度
高包含体外细胞实验（细胞系结合、激活、细胞毒性）、报告细胞系统（NKG2D-2B4）及竞争性阻断实验，涵盖结合验证、功能验证和机制验证。
主要模型
NKL细胞（NK细胞系） Daudi细胞（CD20+MICA- B淋巴瘤细胞系） NKG2D-2B4报告细胞
重点核对
MS-Ig的浓度梯度（0-10 μg/mL）及最佳杀伤浓度1 μg/mL 效应细胞与靶细胞比例（E:T）梯度（1:1至25:1） 竞争性阻断蛋白rMICA和NKG2D-Ig的浓度（10 μg/mL） CD20和NKG2D表面表达验证 IFN-γ和CD107a的检测
摘要
目前为自然杀伤（NK）细胞设计的嵌合抗原受体（CAR）结构大多基于CAR-T细胞的知识。尽管这些CAR-NK细胞已显示出有前景的效果，但其应用仍存在许多局限性。在本研究中，我们设计了一种可溶性NK-CAR，因为NK细胞表达的膜蛋白NKG2D可通过与其配体MICA结合直接触发NK细胞毒性。该CAR由三个片段组成：MICA的胞外域、抗CD20单链可变片段（抗CD20 ScFv）和人IgG Fc组分。将可溶性NK-CAR的核苷酸序列克隆到真核表达载体中，并在悬浮HEK293细胞中表达，随后通过金黄色葡萄球菌蛋白A柱纯化重组NK-CAR蛋白。这种新型NK-CAR表现出双功能活性，既能识别靶细胞的CD20抗原，又能识别NKL细胞的NKG2D受体。NK-CAR激活NKG2D受体信号通路，使NKL细胞表达CD107a并分泌干扰素-γ。可溶性NK-CAR在体外介导NKL细胞杀伤CD20+ Daudi细胞，1 µg/mL的浓度诱导最大杀伤效果。此外，在效应细胞与靶细胞比例为10:1时，51.7%（p < 0.01）的Daudi细胞被杀伤。在重组rMICA和NKG2D-Ig蛋白存在的情况下，由于竞争性干扰，这种杀伤效果降低至30%（P < 0.01）。我们的结果强调了这种新型免疫疗法在杀伤靶肿瘤细胞方面的临床应用潜力。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 设计一种可溶性NK-CAR，通过NKG2D-NKG2DL轴介导NK细胞对CD20+淋巴瘤细胞的特异性杀伤。
- 核心机制
- 可溶性NK-CAR（MS-Ig）通过其MICA胞外域与NK细胞的NKG2D受体结合，并通过抗CD20 ScFv与靶细胞CD20结合，作为桥梁连接效应细胞与靶细胞，从而激活NKG2D信号通路，促使NK细胞释放IFN-γ和表达CD107a，并增强对靶细胞的杀伤。
- 主要证据
- 流式细胞术证实MS-Ig可特异性结合Daudi细胞和NKL细胞；NKG2D-2B4报告细胞实验显示固定化MS-Ig激活NKG2D信号通路；细胞毒性实验表明1 μg/mL MS-Ig及E:T=10:1时杀伤率显著，且rMICA和NKG2D-Ig可竞争性抑制杀伤。
- 研究意义
- 该可溶性NK-CAR可能作为一种无需个性化治疗的药物，通过招募自身NK细胞杀伤肿瘤细胞，具有临床转化潜力。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
验证MS-Ig的双重结合活性
验证MS-Ig能否同时特异性识别靶细胞CD20抗原和效应细胞NKG2D受体。
通过流式细胞术检测MS-Ig与Daudi细胞（CD20+MICA-）和NKL细胞的结合，并使用抗CD20抗体、rMICA和NKG2D-Ig进行阻断实验。
检测NKG2D受体信号通路激活
验证MS-Ig能否激活NKG2D受体信号通路。
使用NKG2D-2B4报告细胞，检测固定化MS-Ig对GFP表达的影响，并检测可溶性MS-Ig和对照蛋白。
检测NKL细胞激活
验证MS-Ig能否激活NKL细胞，通过CD107a表达和IFN-γ分泌评估。
将NKL细胞与固定化MS-Ig共孵育，检测CD107a；将NKL细胞与CD20+靶细胞和可溶性MS-Ig共孵育，检测IFN-γ分泌。
评估MS-Ig介导的细胞毒性
验证可溶性MS-Ig能否介导NKL细胞对CD20+靶细胞的特异性杀伤。
使用CFSE标记靶细胞，以不同E:T比例和MS-Ig浓度进行细胞毒性实验，流式细胞术检测7-AAD阳性凋亡细胞比例。
机制验证：NKG2D-NKG2DL轴的作用
证实MS-Ig通过NKG2D-NKG2DL轴介导靶细胞杀伤。
在最佳杀伤条件下，加入竞争性蛋白rMICA或NKG2D-Ig，检测杀伤效率和IFN-γ分泌的变化。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | RPMI 1640基础培养基 | Gibco | 11875500BT |
| 胎牛血清 | Gibco | 10099141 | |
| 白细胞介素-2 | PeproTech | 200-02-50UG | |
| SMM 293-TII培养基 | Sino Biological Inc. | M293TII | |
| 分子克隆 | HindIII限制性内切酶 | NEB | R3104V |
| BamHI限制性内切酶 | NEB | R3136V | |
| T4连接酶 | Invitrogen | EL0011 | |
| 蛋白表达与纯化 | 聚乙烯亚胺（25 kDa线性PEI） | Polysciences Inc. | 23966 |
| 蛋白纯化 | 超滤柱（Ultra-4） | Amicon | -- |
| 镍离子亲和层析 | Bestchrom | -- | |
| 咪唑 | Sigma | 288-32-4 | |
| 蛋白检测 | 考马斯亮蓝染料 | Sigma | R-250 |
| Western blot | HRP标记的抗小鼠IgG Fc抗体 | Jackson Immuno Research Labs | 115-035-071 |
| HRP标记的抗人IgG Fc抗体 | Jackson Immuno Research Labs | 109-035-098 | |
| 流式细胞术 | PE标记的抗人CD20抗体 | eBioscience | 12-0209-41 |
| PE标记的抗小鼠IgG (H+L)抗体 | SouthernBiotech | 1034-09 | |
| PE标记的抗CD3抗体 | Biolegend | 344816 | |
| PE标记的抗NKG2D抗体 | Biolegend | 320806 | |
| PE标记的抗CD107a抗体 | BioLegend | 328608 | |
| PE标记的抗小鼠IgG1抗体 | Biolegend | 400113 | |
| PE标记的抗人IgG Fc抗体 | eBioscience | 12-4998-82 | |
| 细胞毒性实验 | CellTrace CFSE细胞增殖试剂盒 | Fisher Scientific | C34554 |
| IFN-γ检测 | IFN-γ ELISA试剂盒 | 4A BIOTECH Co., Ltd. | CHE0017 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养 | 所有细胞系均使用RPMI 1640培养基，含10% FBS；NKL细胞需额外添加10 ng/mL IL-2；HEK293细胞使用无血清SMM 293-TII培养基。 阅读提示：Materials and Methods: Cell lines and culture |
| 蛋白表达与纯化 | PEI转染条件：质粒(µg)与PEI(µL)比例1:3，孵育15分钟，DNA终浓度1 µg/mL；收集转染后3-4天上清。 阅读提示：Materials and Methods: Expression and purification of the fusion protein |
| MS-Ig结合检测 | MS-Ig浓度10 µg/mL，与细胞孵育30分钟（4°C）；使用PE抗人IgG Fc检测，需设对照组。 阅读提示：Materials and Methods: Flow cytometric analysis of MS-Ig binding |
| NKG2D激活检测 | NKG2D-2B4细胞浓度5×10^4 cells/mL，每孔200 µL；MS-Ig浓度10 µg/mL；孵育16小时。 阅读提示：Materials and Methods: NKG2D receptor activation and detection |
| NKL细胞激活检测 | 固定化MS-Ig浓度10 µg/mL，包被4小时；NKL细胞数2×10^5；共培养4小时；IFN-γ检测使用ELISA。 阅读提示：Materials and Methods: NKL cell activation and detection |
| 细胞毒性实验 | 靶细胞5×10^4/孔；E:T比例1:1至25:1；MS-Ig浓度梯度；共培养4小时；7-AAD染色。 阅读提示：Materials and Methods: Cytotoxicity test |
| 统计设计 | 至少三次独立重复；百分比数据用卡方检验；定量数据用独立样本t检验；P<0.05为显著。 阅读提示：Materials and Methods: Statistical analysis |