纳米抗体筛选与鉴定
从骆驼免疫文库中筛选RBD特异性纳米抗体并鉴定其结合表位
用RBD免疫骆驼，构建噬菌体展示文库，进行两轮生物淘选，通过ELISA鉴定29个阳性克隆，并用SEC和BLI分为三组非竞争性表位
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中和SARS-CoV-2变体的纳米抗体的结构基础
Structural basis of nanobodies neutralizing SARS-CoV-2 variants.
实验完整度
高包含体外结合实验（BLI、ELISA）、假病毒中和实验、活病毒PRNT、X射线晶体结构解析等多层级验证，并进行了结构指导的突变体设计和功能验证。
主要模型
HEK293F细胞 Vero E6细胞 骆驼免疫模型 SARS-CoV-2假病毒和活病毒
重点核对
纳米抗体与RBD的结合亲和力（KD值） 纳米抗体阻断ACE2与RBD结合的IC50 假病毒和活病毒中和实验的IC50/ND50 晶体结构分辨率及Rwork/Rfree
摘要
由于SARS-CoV-2的进化变体，迫切需要开发能够抵抗病毒逃逸的广谱中和抗体。我们从用SARS-CoV-2刺突蛋白受体结合域（RBD）免疫的骆驼中鉴定了一组高亲和力纳米抗体，并使用X射线晶体学解析了两种非竞争性纳米抗体（NB1A7和NB1B11）与RBD复合物的结构。结构显示，NB1A7靶向SARS-CoV-2变体和其他一些冠状病毒共有的高度保守的隐蔽表位，并阻断刺突蛋白的ACE2受体附着，而NB1B11表位与ACE2的接触表面重叠，且与NB1A7的结合位点不同。这两种纳米抗体被共价连接成多价和双互补位形式，显著提高了亲合力与中和效力，并可能进一步抑制病毒逃逸。这些结果有助于针对SARS-CoV-2未来变体的抗体结构导向设计，以对抗冠状病毒流行病和大流行。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 如何开发能够抵抗SARS-CoV-2变体逃逸的广谱中和抗体？
- 核心机制
- NB1A7结合RBD保守隐蔽表位，通过空间位阻阻断ACE2结合，并稳定RBD向上构象导致刺突蛋白提前失活；NB1B11直接与ACE2结合位点重叠阻断病毒附着。
- 主要证据
- X射线晶体结构显示NB1A7和NB1B11结合不同表位；BLI显示高亲和力（KD分别为0.74 nM和6.76 nM）；竞争ELISA和PRNT证实其中和活性。
- 研究意义
- 为基于结构设计针对SARS-CoV-2未来变体的广谱中和抗体提供了概念验证和候选分子。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
功能验证：ACE2阻断与病毒中和
评估纳米抗体阻断ACE2结合和中和SARS-CoV-2病毒的能力
通过竞争ELISA检测NB1A7和NB1B11抑制RBD与ACE2结合，使用假病毒中和实验和活病毒PRNT测定中和活性
晶体结构解析
解析纳米抗体与RBD复合物的晶体结构，阐明中和机制
通过X射线晶体学解析RBD-NB1A7和RBD-NB1B11复合物结构，分辨率分别为2.00 Å和2.08 Å，分析相互作用界面和构象变化
基于结构的双互补位纳米抗体设计与验证
通过连接两种纳米抗体提高亲和力和中和效力
设计format I和format II双互补位纳米抗体，用BLI检测结合亲和力，用竞争ELISA和假病毒中和实验检测活性，并用PRNT验证活病毒中和
针对突变毒株的交叉反应性评估
评估纳米抗体对SARS-CoV-2变体RBD的结合和抑制活性
用BLI和竞争ELISA检测对P.1、B.1.526、B.1.617.1、B.1.617.2等突变体的结合亲和力和ACE2抑制活性
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | FreeStyle 293-F细胞 | Gibco | 11625019 |
| 蛋白纯化 | 抗FLAG M2亲和树脂 | Smart-Lifesciences | SA042C |
| 重组蛋白A琼脂糖珠 | SMART LIFESCIENCES | -- | |
| 噬菌体展示 | pMECS噬菌粒载体 | -- | -- |
| BLI检测 | ForteBio Octet Red96e系统 | ForteBio | -- |
| X射线衍射 | BL19U1光束线 | Shanghai Synchrotron Radiation Facility | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 蛋白表达与纯化 | HEK293F细胞密度2×10^6 cells/ml，PEI转染，10 mM丁酸钠，30°C培养48小时收获 阅读提示：STAR★Methods, 'Protein expression and purification' |
| 纳米抗体筛选 | 两轮生物淘选，每轮孵育2小时，PBST洗涤10次，PBS 5次 阅读提示：STAR★Methods, 'Screening and identification of Nbs by phage display technology' |
| 结构解析 | 结晶条件：NB1A7-RBD使用8% PEG6000、0.1 M柠檬酸pH 3.5、2%乙二醇；NB1B11-RBD使用16% PEG3350、0.1 M乙酸锌 阅读提示：STAR★Methods, 'Crystallization and data collection' |
| 中和实验 | 假病毒中和：HEK293T-ACE2细胞，纳米抗体100 μg/mL至0.0000512 μg/mL五倍稀释；PRNT：Vero E6细胞1.5×10^6 cells/well，病毒200 TCID50 阅读提示：STAR★Methods, 'Pseudotyped virus neutralization' and 'Authentic SARS-CoV-2 plaque reduction neutralization test (PRNT)' |