植物提取物筛选
从岭南地区药用植物中发现抗埃博拉病毒的活性先导物。
收集500多种岭南药用植物提取物，利用EBOVpp假病毒系统进行筛选，识别出M. perlarius。
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从珍珠紫珠中发现的埃博拉病毒进入抑制剂
Ebola Entry Inhibitors Discovered from Maesa perlarius.
实验完整度
高包含基于假病毒的体外筛选、BSL-4感染性病毒验证、生物测定指导的化合物分离、合成衍生物活性评价、分子对接与MST结合实验等多层级验证。
主要模型
A549细胞中的EBOVpp假病毒模型 VERO E6细胞中的感染性EBOV模型 293T细胞中的假病毒生产体系
重点核对
EBOVpp假病毒抑制实验在A549细胞中进行，每孔4000个细胞，72小时感染，IC50值需在三种独立实验中测定。 感染性EBOV实验使用VERO E6细胞，MOI=1，感染后1小时再次加样，48小时固定检测。 MPBE提取物和活性组分的IC50值：MPBE对EBOVpp为0.52 µg/mL，对感染性EBOV为7.47 µg/mL。 MST结合实验中EBOV-GP-His6在293T细胞中表达，靶蛋白浓度25 nM，化合物浓度系列1.52 nM至50 µM。 分子对接使用AutoDock Vina，靶蛋白为EBOV-GP晶体结构5JQ7，网格参数覆盖原配体结合位点。
摘要
埃博拉病毒病（EVD）是由埃博拉病毒（EBOV）感染引起的一种疾病，以出血热和高病死率为特征。由于EVD的治疗选择有限，迫切需要开发抗埃博拉病毒的治疗药物。在本研究中，测试了岭南地区采集的500多种药用植物提取物对埃博拉病毒假颗粒（EBOVpp）感染的抑制作用，发现了珍珠紫珠（Maesa perlarius）作为抗EBOV的植物先导物。该植物茎的甲醇提取物（MPBE）对EBOVpp表现出抑制作用，IC50值为0.52 µg/mL，并在生物安全4级实验室中通过针对感染性EBOV的测试证实了这一点。通过生物测定指导的MPBE分级分离，得到三种原花青素（原花青素B2 (1)、原花青素C1 (2)和表儿茶素-(4β→8)-表儿茶素-(4β→8)-表儿茶素-(4β→8)-表儿茶素 (3)），以及两种黄烷-3-醇（(+)-儿茶素 (4)和(−)-表儿茶素 (5)）。这些化合物对带有埃博拉病毒糖蛋白的假病毒颗粒的IC50值范围为0.83至36.0 µM，其中1是最有效的抑制剂。进一步研究了五种合成衍生物以及六种市售类似物（包括EGCG（(−)-表没食子儿茶素-3-O-没食子酸酯 (8)））的抗EBOV活性。分子对接分析和结合亲和力测量提示埃博拉病毒糖蛋白可能是1及其相关化合物的潜在分子靶点。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 从岭南地区药用植物中筛选具有抗埃博拉病毒活性的天然产物。
- 核心机制
- 原花青素B2及其相关化合物通过与EBOV糖蛋白结合（可能结合在已知的toremifene结合腔）来抑制病毒进入。
- 主要证据
- 利用EBOVpp假病毒筛选出M. perlarius，从中分离出多种黄烷-3-醇和原花青素，通过分子对接和MST实验证实原花青素B2与EBOV-GP直接结合。
- 研究意义
- 本研究首次报道原花青素类化合物具有抗EBOV活性，并为靶向EBOV-GP的抗病毒药物设计提供了黄烷-3-醇单体及寡聚体作为先导物框架。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
提取物活性确认
验证M. perlarius提取物的抗EBOV活性。
测定M. perlarius茎甲醇提取物（MPBE）对EBOVpp的IC50，并在BSL-4实验室用感染性EBOV验证。
活性组分的分离与纯化
通过生物测定指导的分级分离获得活性单体化合物。
MPBE经硅胶柱层析、ODS反相柱、Sephadex LH-20及制备型HPLC分离，得到五个化合物。
分离化合物的抗EBOV活性评价
测定分离化合物对EBOVpp的抑制活性，并比较结构活性关系。
对分离的化合物及市售类似物进行EBOVpp抑制实验，测定IC50值。
合成ECG类似物并评价活性
研究C-3位酯基对抗EBOV活性的影响。
以(−)-表儿茶素为原料，经过苄基保护、酯化、脱保护合成多种酯类衍生物，并在10 µM浓度下测试其对EBOVpp的抑制效果。
分子靶点验证
验证EBOV-GP是否为原花青素B2及其相关化合物的分子靶点。
利用分子对接和MST实验测定化合物与EBOV-GP的结合。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 提取与分离 | 甲醇 | -- | -- |
| 硅胶 | Davisil | -- | |
| 葡聚糖凝胶LH-20 | Amersham BioSciences | -- | |
| ODS RP-18硅胶 | Merck | -- | |
| 高效液相色谱系统 | Agilent Technologies | Series 1100 | |
| Thermo-C18色谱柱 | -- | 150 × 4.6 mm | |
| YMC-Pack ODS-A色谱柱 | YMC | S-5 μm, 12 nm, 250 × 20 mm | |
| 高分辨质谱仪 | Agilent Technologies | 6540 | |
| 旋光仪 | JASCO | P-1010 | |
| 圆二色谱仪 | Olis | DSM 172 | |
| 傅里叶变换红外光谱仪 | PerkinElmer | Spectrum One | |
| 紫外可见分光光度计 | Varian | Cary 50 | |
| 核磁共振波谱仪 | Bruker | Ascend 400 MHz | |
| 化合物合成 | 苄溴 | -- | -- |
| 碳酸钾 | -- | -- | |
| 4-二甲氨基吡啶 | -- | -- | |
| 氢氧化钯 | -- | -- | |
| 生物活性评价 | 杜氏改良Eagle培养基 | Gibco | -- |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| 磺酰罗丹明B | -- | -- | |
| 紫杉醇 | -- | -- | |
| 假病毒生产 | 脂质体转染试剂3000 | ThermoFisher | -- |
| 假病毒抑制实验 | Neolite报告基因检测系统 | PerkinElmer | -- |
| Envision 2104多功能酶标仪 | Perkin Elmer | -- | |
| 抗感染性EBOV实验 | CellTiter-Glo细胞活力检测试剂 | -- | -- |
| 人抗体KZ52 | -- | -- | |
| Alexafluor 488偶联的抗人二抗 | -- | -- | |
| MST实验 | EBOV-GP表达质粒（C-His标签） | Sino Biological | VG40304-CH |
| pCMV阴性对照质粒 | Sino Biological | CV015 | |
| M-PER裂解缓冲液 | -- | -- | |
| 蛋白酶抑制剂混合物 | Thermo Fisher Scientific | Halt Protease Inhibitor Cocktail, EDTA-Free | |
| Monolith His标签标记试剂盒RED-tris-NTA | NanoTemper Technologies | -- | |
| Monolith NT.115仪器 | NanoTemper Technologies | red/blue | |
| 分子对接 | AutoDock Vina | -- | -- |
| 分析软件 | GraphPad Prism | GraphPad Software | 5.0 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 植物材料与提取 | 植物采集地点和时间、干燥时间、提取溶剂体积和次数、提取时间 阅读提示：Materials and Methods, 4.2 Plant Materials 和 4.3 Extraction and Isolation |
| 分离纯化 | 色谱填料、柱尺寸、洗脱梯度、收集的馏分编号 阅读提示：Materials and Methods, 4.3 Extraction and Isolation 及 Figure 2 图注 |
| 假病毒抑制实验 | 细胞类型、每孔细胞数、感染时间（72小时）、化合物浓度系列（建议八个2倍系列稀释） 阅读提示：Materials and Methods, 4.5 Bioactivity Evaluation Using EBOV Pseudotyped Virus 及 Figure 1 图注 |
| 感染性EBOV实验 | 细胞系（VERO E6）、MOI、感染时间（48小时）、检测方法（免疫染色） 阅读提示：Materials and Methods, 4.6 Antiviral Assay against Infectious Ebola Virus |
| MST结合实验 | 蛋白质表达构建体、标签、浓度、标记试剂、仪器设置（MST power, LED power） 阅读提示：Materials and Methods, 4.8 Microscale Thermophoresis (MST) Experiment |