建立ICI心肌炎小鼠模型
在肿瘤存在与否的情况下，验证联合ICI治疗是否引发心脏毒性及性别差异。
使用MC38、B16F10、EO771肿瘤细胞接种雄性/雌性C57BL/6J小鼠，待肿瘤体积达200-250 mm³后给予抗PD-1和抗CTLA-4抗体（25 mg/kg，i.p.，每3天一次）或IgG对照，进行心电图、超声心动图和心脏组织学检测。
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激素治疗上调MANF并克服女性对免疫检查点抑制剂心肌炎的易感性
Hormonal therapies up-regulate MANF and overcome female susceptibility to immune checkpoint inhibitor myocarditis.
实验完整度
高包含药理学小鼠模型、遗传模型、患者样本、iPS-CMs体外实验，并有心脏特异性基因敲除和重组蛋白回补等功能验证。
主要模型
C57BL/6J小鼠（MC38、B16F10、EO771、RM1肿瘤模型） Ctla4+/−Pdcd1−/−遗传小鼠模型 人iPS细胞来源心肌细胞（iPS-CMs） ICI心肌炎患者心脏组织
重点核对
抗PD-1和抗CTLA-4抗体剂量（25 mg/kg，i.p.，每3天一次） 肿瘤接种细胞数（EO771 1×10^5，MC38 1×10^5，B16F10 0.5×10^5，RM1 1×10^5） 重组MANF（2 μg/kg，i.p.，每日）和HSPA5（7.8 μg/kg，i.p.，每日）处理 LY500307（5 mg/kg，i.p.）和ARN-509（10 mg/kg，口服，每日）给药方案
摘要
免疫检查点抑制剂（ICIs）越来越多地用于癌症联合治疗，但与心肌炎相关。在此，我们报告荷瘤小鼠对抗PD-1（程序性细胞死亡蛋白1）和抗CTLA-4（细胞毒性T淋巴细胞抗原4）抗体联合治疗有反应，但也出现临床上观察到的ICI治疗相关心血管毒性，包括心肌炎和心律失常。雌性小鼠比雄性小鼠更易发生心肌炎，这与先前描述的ICI心肌炎遗传模型以及新兴临床数据一致。机制上，ICI处理小鼠的心肌组织、遗传小鼠模型以及受ICI心肌炎影响的患者的人心脏组织均表现出心脏中MANF（中脑星形胶质细胞源性神经营养因子）和HSPA5（热休克70kDa蛋白5）的下调；这种下调在雌性小鼠中尤为显著。心脏特异性基因敲除小鼠Manf可增强ICI心肌炎，而给予重组MANF蛋白可减轻之，表明其因果作用。讽刺的是，MANF和HSPA5均由配体结合的雌激素受体-β转录诱导，并被雄激素受体抑制。然而，ICI治疗使雌性小鼠血清雌二醇浓度比雄性小鼠降低更多。雌激素受体β特异性激动剂以及雄激素剥夺治疗可减轻ICI相关心脏效应。综上，我们的数据表明ICI治疗抑制心脏中雌激素依赖性MANF/HSPA5表达，削弱心肌细胞对免疫损伤的反应。这一内分泌-心脏-免疫通路为心脏疾病性别差异的机制提供了新见解，并可能为ICI心肌炎提供治疗策略。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 免疫检查点抑制剂相关心肌炎中性别差异的机制是什么？心脏内在保护因子能否作为治疗靶点？
- 核心机制
- ICI治疗降低血清17β-雌二醇浓度，导致雌激素受体β介导的心脏MANF/HSPA5转录下调，削弱心肌细胞对免疫损伤的保护反应，从而加重心肌炎；雄激素受体信号则抑制MANF/HSPA5表达。
- 主要证据
- 药理学ICI小鼠模型和Ctla4+/−Pdcd1−/−遗传模型中，雌性小鼠心肌炎更严重，心脏Manf/Hspa5表达下调；心脏特异性Manf敲除加重心肌炎，重组MANF蛋白减轻心肌炎；人iPS-CMs中E2通过ERβ诱导MANF/HSPA5，DHT通过AR抑制，ERβ激动剂或雄激素剥夺治疗改善心脏功能。
- 研究意义
- 该研究揭示内分泌-心脏-免疫通路，为理解心脏疾病性别差异提供新见解，并提示ERβ激动剂或雄激素剥夺治疗联合ICI可能降低心肌炎风险，扩大免疫治疗的适用性。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
转录组分析心脏差异表达基因
鉴定ICI处理后心脏中性别偏向的下游通路和关键基因。
对ICI或IgG处理的小鼠心脏、肾、肺、肝、骨骼肌进行RNA-seq，鉴定心脏特异差异表达基因（DEGs），并通过RT-qPCR、免疫组化和免疫印迹验证MANF和HSPA5的表达变化。
心脏特异性敲除Manf验证功能
验证Manf下调是否加重ICI诱导的心脏毒性。
通过AAV9递送saCas9和靶向Manf的sgRNA，利用cTnT启动子实现心脏特异性基因敲除，3周后接种B16F10细胞并进行ICI治疗，评估心脏组织学、心电和心功能。
重组MANF/HSPA5蛋白治疗
测试外源性MANF/HSPA5是否能减轻ICI诱导的心脏炎症和功能障碍。
从肿瘤接种前7天开始每日腹腔注射His-tagged MANF（2 μg/kg）和c-Myc-tagged HSPA5（7.8 μg/kg），然后进行肿瘤接种和ICI处理，评估心脏功能、免疫浸润和细胞凋亡。
体外验证性激素对MANF/HSPA5的转录调控
明确雌激素和雄激素对心肌细胞中MANF/HSPA5表达的直接调控及受体机制。
在人iPS-CMs和原代小鼠心肌细胞中，用E2、DHT、LY500307、ARN-509处理，检测MANF/HSPA5 mRNA和蛋白表达；通过ChIP-qPCR检测ERβ和AR在启动子区的招募；使用Esr2敲除和Ar敲除心肌细胞验证依赖性。
激素治疗动物模型验证
在体内验证ERβ激动剂或雄激素剥夺治疗能否通过上调MANF/HSPA5减轻ICI心肌炎。
EO771荷瘤雌性小鼠接受LY500307（5 mg/kg，i.p.），RM1荷瘤雄性小鼠接受ARN-509（10 mg/kg，口服，每日），同时进行ICI治疗，检测心脏中MANF/HSPA5表达、免疫浸润和心功能。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | 基质胶 | Corning | -- |
| mTeSR Plus培养基 | Stemcell Technologies | -- | |
| iPSC分化 | STEMdiff心肌细胞分化试剂盒 | Stemcell Technologies | -- |
| 药物处理 | β-雌二醇 | Sigma-Aldrich | -- |
| 5α-双氢睾酮 | Sigma-Aldrich | -- | |
| LY500307 | APExBIO | -- | |
| ARN-509（阿帕鲁胺） | Cayman Chemical | -- | |
| 细胞因子处理 | 白细胞介素-6 | PeproTech | -- |
| 肿瘤坏死因子-α | PeproTech | -- | |
| 干扰素-γ | PeproTech | -- | |
| 动物实验 | 抗小鼠PD-1抗体 | 文中未明确说明 | -- |
| 抗小鼠CTLA-4抗体 | 文中未明确说明 | -- | |
| 大鼠IgG2a同型对照 | 文中未明确说明 | -- | |
| 基因敲除 | AAV9-cTnT-saCas9 | VectorBuilder | -- |
| AAV9-Manf-sagRNA | VectorBuilder | -- | |
| 重组蛋白 | His标记小鼠MANF重组蛋白 | Sino Biological | 50954-M08H |
| c-Myc标记小鼠HSPA5重组蛋白 | Origene Technologies | TP509794 | |
| RNA提取 | RNeasy小型试剂盒 | QIAGEN | -- |
| cDNA合成 | iScript逆转录超混合液 | Bio-Rad | -- |
| 蛋白裂解 | RIPA裂解液 | EMD Millipore | -- |
| 蛋白酶/磷酸酶抑制剂混合物 | Pierce, Thermo Scientific | -- | |
| 帕比司他 | Selleck Chemicals | -- | |
| Methylstat | Sigma-Aldrich | -- | |
| 成像和定量 | Vectra Polaris定量病理成像系统 | PerkinElmer | -- |
| Image-pro plus 6.0 | Media Cybernetics | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 肿瘤模型建立 | 小鼠品系（C57BL/6J）、年龄（6-8周）、性别、肿瘤细胞系（MC38、B16F10、EO771、RM1）及接种数量、注入部位和肿瘤体积标准 阅读提示：Methods: In vivo xenograft murine models and treatment |
| ICI处理方案 | 抗PD-1和抗CTLA-4抗体的给药剂量（25 mg/kg，i.p.）、给药频率（每3天一次）及治疗起始条件（肿瘤体积200-250 mm³） 阅读提示：Methods: In vivo xenograft murine models and treatment |
| 重组蛋白给药 | rMANF（His-tagged）剂量（2 μg/kg，i.p.，每日）和rHSPA5（c-Myc-tagged）剂量（7.8 μg/kg，i.p.，每日），以及给药时间（肿瘤接种前7天至实验结束） 阅读提示：Methods: In vivo xenograft murine models and treatment |
| 激素治疗 | LY500307剂量（5 mg/kg，i.p.，每日）和ARN-509剂量（10 mg/kg，口服，每日），给药起始时间（肿瘤接种日起） 阅读提示：Methods: In vivo xenograft murine models and treatment |
| AAV介导的Manf敲除 | AAV9血清型、病毒滴度（1.5×10^13 vg/ml）、注射量（2×10^11病毒基因组）、注射方式（左心室注射）和给药时间（5周龄，肿瘤接种前3周） 阅读提示：Methods: AAV-mediated Manf KO |
| iPS-CMs分化与处理 | iPSC细胞系（HSCC-022）、基质胶包被、mTeSR Plus培养、分化试剂盒（STEMdiff）、处理剂浓度（E2 10 nM, DHT 10 nM, LY500307 10 nM, ARN-509 10 nM）和处理时间（1小时或如图注） 阅读提示：Methods: Induced pluripotent stem cells maintenance and differentiation |
| 心脏功能与组织学评估 | ECG记录方式（植入式）、QRS间期、QT间期；超声心动图指标（EF%、FS%）；组织学染色（H&E、mIHC、IHC）及抗体（CD8、F4/80、cleaved caspase 3、MANF、HSPA5） 阅读提示：Methods: Tissue collection and immunohistochemistry; Results 中对应的图例（Fig. 1, 3, 4, 7） |