开发免疫复合物捕获和LC-MS/MS检测方法
建立一种能同时定量多种免疫球蛋白和补体成分的检测方法。
将重组S1蛋白包被在96孔板上，与血清孵育，捕获免疫复合物，经胰蛋白酶消化后进行LC-MS/MS分析。
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定量、多重、靶向蛋白质组学用于确定变异特异性SARS-CoV-2抗体反应
Quantitative, multiplexed, targeted proteomics for ascertaining variant specific SARS-CoV-2 antibody response.
实验完整度
低研究主要基于方法开发和临床样本的检测验证，包含体外免疫捕获实验和临床样本分析，但缺乏动物模型或功能验证。
主要模型
医护人员血清样本 重组SARS-CoV-2 S1蛋白 VeroE6细胞
重点核对
样本量：感染未感染组分别为24和23名医护人员 采样时间：自然感染后8周、第一剂和第二剂疫苗后3周 S1蛋白浓度：50 μg/mL包被 血清稀释：1:10 中和实验：VeroE6细胞，病毒量3×10^4 FFU
摘要
Doykov等人展示了一种检测方法，可揭示免疫球蛋白类别、亚型和补体在疫苗接种、感染和关注变异株反应中的变化。该检测方法可深入了解个体的免疫反应，并有助于疫苗设计和接种。它也可应用于其他抗原和疾病。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 开发一种多重靶向蛋白质组学方法，以更全面地评估个体对SARS-CoV-2及其关注变异株的抗体反应，超越现有总IgG或总抗体检测。
- 核心机制
- C1q与IgG1结合，但与中和抗体的关联更强，尤其是在Delta变异株中，表明C1q可能更能反映针对变异株的中和抗体反应。
- 主要证据
- 通过比较LC-MS/MS检测的IgG1和C1q水平与中和抗体滴度，发现C1q与中和抗体的相关性（r=0.71）高于IgG1（r=0.62），且针对Delta变异株时C1q与IgG1的比值降低。
- 研究意义
- 该检测方法可提供更全面的免疫反应信息，有助于个体免疫监测、疫苗设计，并可用于其他抗原和疾病。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
与金标准血清学和中和实验比较
验证新方法与现有血清学检测和中和实验的一致性。
将LC-MS/MS检测的IgG1水平与Roche Elecsys Anti-S检测和活病毒中和实验进行比较。
评估对不同变异株的免疫反应
比较个体对Wuhan Hu-1及Alpha、Beta、Delta变异株的抗体反应。
使用不同变异株的S1蛋白作为诱饵，检测血清中IgG1、IgM、IgA1、C1q等水平的变化。
评估针对Omicron变异株的反应
确定三剂疫苗接种者对Omicron变异株的抗体和补体反应。
使用Omicron S1蛋白检测三剂疫苗接种者（n=76）血清中的IgG1、IgA1、C1q、C4、C9水平。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 免疫捕获 | Wuhan Hu-1 SARS-CoV-2刺突蛋白(S1) | Genscript | Z03501 |
| Alpha VOC B.1.1.7 SARS-CoV-2刺突蛋白S1(His标签) | Sino biological | 40591-V08H7 | |
| Beta VOC B.1.1351 SARS-CoV-2刺突蛋白S1(His标签) | Genscript | Z03531-1 | |
| Delta VOC B.1.617.2刺突蛋白S1(His标签) | Sino biological | 40591-V08H19 | |
| Omicron(B.1.1.529)刺突蛋白S1 | Native antigen | REC32006-100 | |
| 标准品 | IgG蛋白标准品 | Sigma Aldrich | I4506 |
| 血清学检测 | Cobas® SARS-CoV-2逆转录聚合酶链反应检测 | ROCHE | 09425217001A-01 |
| 抗SARS-CoV-2 ELISA | EUROIMMUN | EI 2606-9601 G | |
| Elecsys®抗SARS-CoV-2检测 | ROCHE | 09 203 095 190 | |
| 中和实验 | CLARIOStar酶标仪 | BMG Labtech | -- |
| LC-MS/MS分析 | Waters Xevo-TQ-S三重四极杆质谱仪 | Waters | -- |
| Skyline开源软件V.21.2 | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 样本收集 | 样本来源：COVIDsortium医护人员；采样时间：感染后8周、疫苗第一剂后3周、第二剂后3周；样本量：感染未感染组n=24，既往感染组n=23；三剂疫苗组n=76（未感染n=25，既往感染n=36） 阅读提示：STAR Methods, Experimental model and subject details |
| 免疫捕获 | S1蛋白浓度：50 μg/mL；包被体积：10 μL；包被时间：12-16小时；封闭液：1 mg/mL horse myoglobin in PBS；血清稀释度：1:10；孵育时间：1小时；洗涤步骤 阅读提示：STAR Methods, Bait capture |
| 蛋白消化 | 还原剂：DTT（162 mM）；烷基化剂：IAA（162 mM）；酶：trypsin（1 mg/mL）；消化时间：30分钟；温度：45°C 阅读提示：STAR Methods, Immunocomplex protein digestion |
| LC-MS/MS分析 | 色谱柱：Waters UPLC Premier C18 1.7 μm；流动相：0.1%甲酸水溶液和0.1%甲酸乙腈；流速：0.3 mL/min；梯度：5% B至40% B，7.7分钟；质谱参数：毛细管电压2.8 kV，离子源温度150°C，去溶剂气温度600°C 阅读提示：STAR Methods, Targeted LC-MS/MS analysis |
| 中和实验 | 细胞：VeroE6；病毒量：3×10^4 FFU；血清稀释：热灭活；孵育：37°C，1小时；检测：结晶紫染色，570 nm吸光度 阅读提示：STAR Methods, Authentic virus neutralisation assay |