Myd88在S1WT诱导过度炎症和紧急髓系造血中的作用
确定Myd88是否介导S1WT诱导的炎症和造血反应
将S1WT或flagellin注射至Myd88缺陷和野生型斑马鱼幼虫后脑室，在6、12、24 hpi观察免疫细胞募集和总数，并在12 hpi检测炎症基因表达和24 hpi检测caspase-1活性。
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SARS-CoV-2的刺突蛋白在斑马鱼中通过Tlr2传导信号
The Spike protein of SARS-CoV-2 signals via Tlr2 in zebrafish.
实验完整度
高包含基因敲除（CRISPR/Cas9）和突变体（Myd88缺陷）的功能验证，体内成像观察免疫细胞募集，RT-qPCR和Caspase-1活性检测，以及多种转基因报告系，证据层级至少两个。
主要模型
斑马鱼幼虫（Tg(mpx:eGFP)、Tg(lyz:dsRED2)、Tg(mfap4:mCherry)、Tg(NFkB-RE:eGFP)等） 斑马鱼Myd88突变体（myd88hu3668/hu3568） 斑马鱼Tlr2敲低模型（CRISPR/Cas9）
重点核对
S1WT注射浓度0.25 mg/ml，注射部位为48 hpf幼虫后脑室，每只注射1 nl CRISPR/Cas9注射：gRNA浓度250 ng/μl，Cas9 500 ng/μl，注射至1-8细胞期胚胎卵黄囊 观察时间点：3、6、12、24 hpi（免疫细胞募集和Nfkb活性） 基因敲低效率约70%，并通过TIDE确认 使用阴性对照gRNA和阳性质控flagellin
摘要
针对入侵病原体（包括病毒）最深入研究的防御机制之一是Toll样受体（TLRs）。其中，TLR3、TLR7、TLR8和TLR9在内体区室中检测不同形式的病毒核酸，而TLR2和TLR4在细胞外识别病毒结构蛋白和非结构蛋白。尽管许多不同的TLR已被证明参与SARS-CoV-2感染和不同结构蛋白的识别，但大多数研究在体外进行，获得的结果相当矛盾。在本研究中，我们利用斑马鱼模型在体内成像和基因编辑方面的独特优势，报道了来自武汉株的刺突蛋白S1结构域（S1WT）通过Tlr2/Myd88信号通路诱导斑马鱼幼虫的过度炎症，且不依赖白细胞介素-1β的产生。此外，S1WT还触发了紧急髓系造血，但在这种情况下通过Tlr2/Myd88非依赖性信号通路。这些结果揭示了鱼类宿主对病毒蛋白反应的机制。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- SARS-CoV-2刺突蛋白S1结构域在斑马鱼中是否通过Tlr2/Myd88信号通路诱导过度炎症和紧急髓系造血？
- 核心机制
- S1WT通过Tlr2/Myd88信号通路诱导过度炎症，但不依赖Il1b产生；紧急髓系造血则独立于Tlr2/Myd88信号通路。
- 主要证据
- 在Myd88缺陷和Tlr2敲低斑马鱼幼虫中，S1WT诱导的免疫细胞募集、Nfkb活性和炎症因子表达均降低，而髓系细胞数量不受影响；Il1b缺失不影响炎症反应。
- 研究意义
- 本研究提供了斑马鱼模型，用于研究SARS-CoV-2刺突蛋白引起的炎症和造血反应，有助于理解COVID-19相关细胞因子风暴和紧急造血的机制。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
Il1b在S1WT诱导过度炎症中的作用
测试Il1b是否参与S1WT诱导的炎症反应
通过CRISPR/Cas9敲除il1b基因，然后注射S1WT，观察免疫细胞募集、Nfkb活性、炎症基因表达和caspase-1活性。
Tlr2在S1WT诱导过度炎症中的作用
确定Tlr2是否介导S1WT诱导的炎症反应
检测S1WT注射后tlr2等基因表达变化，并通过CRISPR/Cas9敲低tlr2，观察免疫细胞募集、Nfkb活性和炎症基因表达。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| RNA提取 | TRIzol试剂 | Invitrogen | -- |
| 逆转录 | SuperScript IV RNase H逆转录酶 | Invitrogen | -- |
| 实时PCR | SYBR Green PCR核心试剂 | Applied Biosystems | -- |
| ABIPRISM 7500 | Applied Biosystems | -- | |
| CRISPR注射 | Cas9核酸酶V3 | IDT | 1081058 |
| 阴性对照crRNA | IDT | 1072544 | |
| 蛋白注射 | 重组His标签刺突S1野生型蛋白 | Sino Biological | 40591-V08B1 |
| 鞭毛蛋白 | Invivogen | -- | |
| Caspase-1活性检测 | Z-YVAD-AFC | Calbiochem | -- |
| 活体成像 | Leica MZ16F荧光体视显微镜 | Leica | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 斑马鱼品系与饲养 | 所用转基因和突变体品系的具体来源及饲养条件，如Tg(mpx:eGFP)、Tg(lyz:dsRED2)、Tg(mfap4:mCherry)、Tg(NFkB-RE:eGFP)和myd88突变体等。 阅读提示：Methods部分‘Animals’小节 |
| CRISPR/Cas9基因敲除 | crRNA序列、浓度、注射量和胚胎期，以及敲除效率确认方法。 阅读提示：Methods部分‘CRISPR and recombinant protein injections’小节及补充表S2 |
| S1WT注射与剂量 | S1WT蛋白浓度0.25 mg/ml，注射体积1 nl，注射部位为48 hpf幼虫后脑室。 阅读提示：Methods部分‘CRISPR and recombinant protein injections’小节 |
| 体内成像与细胞计数 | 成像时间点（3、6、12、24 hpi），使用的荧光显微镜型号，以及细胞计数方法（视觉计数和ImageJ分析）。 阅读提示：Methods部分‘In vivo imaging’小节 |
| 基因表达分析 | RNA提取方法、逆转录条件、实时PCR所用仪器和试剂，以及内参基因rps11。 阅读提示：Methods部分‘Analysis of gene expression’小节 |