疫苗候选物制备与表征
生产重组VSV△G-SARS-CoV-2病毒并确认病毒颗粒特性。
通过基因替换构建病毒，在Vero细胞中生产，经纯化后使用cryo-TEM和流式病毒学分析颗粒大小和纯度。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
通过流式病毒学对COVID-19疫苗候选物进行功能分析
Functional profiling of Covid 19 vaccine candidate by flow virometry.
实验完整度
中主要采用流式病毒学和Simple Western验证S蛋白表达、抗原性和稳定性，辅以cryo-TEM和假病毒结合实验，但缺少体内功能验证。
主要模型
重组VSV病毒（VSV△G-SARS-CoV-2） HIV-1假病毒颗粒
重点核对
流式病毒学检测的病毒颗粒浓度需达到1x10^9颗粒/mL 抗体标记条件：100 μL样品与1 μL一抗孵育1小时，然后与3 μL二抗孵育1小时 热处理（37℃或45℃ 7天）和γ辐照（16 kGy）用于病毒灭活实验 储存稳定性：样品在4℃储存约一个月后检测S1和S2结合
摘要
疫苗开发是一个复杂的过程，从发现阶段选择有前景的免疫原开始，随后进入临床前阶段的过程开发，之后进行临床试验，同时伴随过程改进和放大。需要一整套分析技术来了解疫苗候选物，以便选择相关的免疫原并在产品生命周期中持续一致地生产。对于病毒疫苗，成功的免疫原生产取决于其保持的抗原性和/或感染性，以及在这种背景下表征这些特性的能力，包括过程、配方和临床表现。在本报告中，我们展示了流式病毒学在基于水疱性口炎病毒（VSV）表达的SARS-CoV-2刺突（S）蛋白的COVID-19疫苗候选物临床前开发中的实用性。使用一组单克隆抗体，我们能够检测重组VSV病毒表面的S蛋白，监测表达水平，检测基于S蛋白序列和病毒灭活后的抗原差异，并监测S蛋白的稳定性。总的来说，流式病毒学提供了重要数据，有助于指导该疫苗候选物的临床前开发。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 流式病毒学能否用于表征COVID-19疫苗候选物（基于表达SARS-CoV-2 S蛋白的VSV病毒）的功能特性，包括S蛋白表达、抗原性、灭活后抗原变化和储存稳定性。
- 核心机制
- S蛋白表达水平差异影响流式病毒学信号，且S1/S2切割导致S1亚基从病毒颗粒上解离，影响抗体结合。
- 主要证据
- 流式病毒学和Simple Western检测显示不同克隆和批次的S蛋白表达差异；假病毒结合实验显示S蛋白变体之间的表位差异；γ辐照比热处理更能保持抗原性；储存后S1亚基解离导致抗S1抗体结合丧失。
- 研究意义
- 流式病毒学是一种强大的工具，可在疫苗开发的发现和临床前阶段监测候选疫苗的关键属性，指导决策，并可用于实时过程监控。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
S蛋白检测与表达水平监测
验证病毒颗粒表面S蛋白的存在，并比较不同克隆和批次的表达水平。
使用抗S蛋白抗体和ACE2-Fc进行流式病毒学染色，并用Simple Western进行正交验证。
S蛋白变体抗原性比较
评估S蛋白序列变异（疫苗候选物与2P构建体）对抗原性的影响。
制备表达2P变体的HIV-1假病毒，与疫苗候选物比较抗体结合比例。
病毒灭活对S蛋白抗原性的影响
评估热处理和γ辐照对病毒S蛋白抗原性的影响。
对样品进行热处理或γ辐照，然后通过流式病毒学测量抗体结合能力。
S蛋白储存稳定性评估
监测储存期间S蛋白的降解和亚基解离。
储存样品在4℃约一个月后，通过流式病毒学和Simple Western分析S1和S2的结合及分布。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 病毒生产与纯化 | VP-SFM培养基 | ThermoFisher Scientific | -- |
| 病毒纯化 | Sartoclean CA 3 µm/0.8 µm过滤器 | Sartorius | -- |
| CaptoCore 700色谱介质 | Cytiva | -- | |
| 假病毒制备 | Fugene6转染试剂 | Promega | -- |
| LentiX浓缩器 | Takarabio | -- | |
| 流式病毒学 | Apogee A50 Micro流式细胞仪 | Apogee Flow Systems | -- |
| AlexaFluor 488标记二抗 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| Simple Western | Simple Western系统 | ProteinSimple | -- |
| 抗体标记 | 人ACE2-Fc融合蛋白 | Acro Biosystems | -- |
| AM91337抗体 | Active Motif | -- | |
| AM91339抗体 | Active Motif | -- | |
| AM91341抗体 | Active Motif | -- | |
| AM91347抗体 | Active Motif | -- | |
| AM91349抗体 | Active Motif | -- | |
| AM91351抗体 | Active Motif | -- | |
| AM91361抗体 | Active Motif | -- | |
| 40150-D003抗体 | Sino Biological | -- | |
| 40591-MM43抗体 | Sino Biological | -- | |
| 40592-R001抗体 | Sino Biological | -- | |
| GTX135356抗体 | GeneTex | -- | |
| GTX632604抗体 | GeneTex | -- | |
| MP8720411抗体 | MP Biomedicals | -- | |
| MP8720301抗体 | MP Biomedicals | -- | |
| 流式病毒学二抗 | 抗人二抗 | Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc. | 709-545-149 |
| 抗鼠二抗 | Invitrogen | A21202 | |
| 抗兔二抗 | Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc. | 711-545-152 | |
| Simple Western二抗 | 抗兔二抗 | Protein Simple | 042-206 |
| Simple Western一抗 | 40592-T62抗体 | Sino Biological | -- |
| 40590-T62抗体 | Sino Biological | -- | |
| REA005抗体 | Imanis Life Sciences | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 流式病毒学检测 | 病毒颗粒浓度：1x10^9颗粒/mL；触发阈值设置；系统适用性检查（清洗至背景<2x10^6颗粒/mL） 阅读提示：Materials and Methods 2.4 和 2.5 |
| 抗体标记 | 一抗和二抗的浓度和孵育时间；未结合抗体的去除方法（CaptoCore 700树脂） 阅读提示：Materials and Methods 2.5 |
| 病毒灭活 | 热处理温度和时间（37℃/45℃ 7天）；γ辐照剂量（16 kGy） 阅读提示：Results 3.4 和 Figure 5 |
| 储存稳定性 | 储存温度和时间（4℃约一个月）；离心条件（16,000 g，30分钟） 阅读提示：Results 3.5 和 Figure 6 |