设计并表达单体刺突蛋白STFK
获得高表达、高纯度的单体刺突蛋白作为疫苗抗原候选。
基于Wuhan-Hu-1株设计不同C端截短的furin位点突变刺突蛋白，在CHO细胞中表达，筛选出STFK（aa1-1192）作为候选，并通过SEC-HPLC和native-PAGE确认其单体形式。
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谱系嵌合和突变修补的刺突蛋白用于广谱COVID-19疫苗
Lineage-mosaic and mutation-patched spike proteins for broad-spectrum COVID-19 vaccine.
实验完整度
高包含体外蛋白表达纯化、免疫原性评价（小鼠、猴、仓鼠）、病毒中和实验、cryo-EM结构解析、仓鼠攻毒保护实验和传播阻断实验，多层次功能与机制验证。
主要模型
BALB/c小鼠 LVG叙利亚仓鼠 恒河猴 H1299-huACE2细胞 Vero细胞
重点核对
疫苗剂量：10 μg/剂，肌内注射，两剂间隔3周 攻毒病毒株：祖先SARS-CoV-2（1×10^4 PFU）、Beta变异株（1×10^4 PFU）、Omicron BA.1（1×10^5 PFU） 中和抗体检测：基于VSV和慢病毒的假病毒中和实验，以及活病毒微量中和实验 病毒RNA定量：qRT-PCR检测肺、鼻甲、气管组织中的病毒RNA 统计学方法：Mann-Whitney U检验、Kruskal-Wallis检验等
摘要
SARS-CoV-2在人类中的传播导致新变异株的不断出现，凸显了对具有广谱抗原覆盖的疫苗的需求。利用谱系间嵌合和突变修补策略，我们工程化了一种重组单体刺突变异体（STFK1628x），其包含多个SARS-CoV-2变异株的关键区域和残基。STFK1628x表现出高免疫原性，并与其原型形式（STFK）具有互补的抗原性。在仓鼠中，由STFK和STFK1628x组成的二价疫苗诱导了针对19种流行SARS-CoV-2变异株（包括Omicron亚系BA.1、BA.1.1、BA.2、BA.2.12.1、BA.2.75和BA.4/5）的高滴度广谱中和抗体。此外，该疫苗对SARS-CoV-2祖先株或免疫逃逸的Beta和Omicron BA.1的鼻内攻击提供了强有力的保护。引人注目的是，在仓鼠中接种二价疫苗有效地阻断了祖先SARS-CoV-2、Beta变异株和Omicron BA.1在笼内从接种疫苗的动物向未接种疫苗的哨兵动物的病毒传播。因此，我们的研究为开发下一代COVID-19疫苗提供了见解和抗原候选物。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 如何设计一种能够提供广谱抗原覆盖、应对SARS-CoV-2变异株免疫逃逸的疫苗抗原？
- 核心机制
- 通过谱系间嵌合和突变修补策略，将不同变异株的关键抗原区域（如NTD和RBD突变）整合到单体刺突蛋白中，获得与原型抗原互补的抗原性，从而诱导广谱中和抗体反应。
- 主要证据
- 在仓鼠模型中，二价疫苗（STFK+STFK1628x）诱导了针对19种变异株的高滴度中和抗体，并提供了对祖先株、Beta和Omicron BA.1攻毒的保护，同时阻断了病毒传播。
- 研究意义
- 该研究为开发针对免疫逃逸变异株的下一代COVID-19疫苗提供了策略和抗原候选物。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
评价STFK的免疫原性
验证STFK在小鼠、猴和仓鼠中的免疫原性。
用STFK疫苗（含FH002C佐剂）免疫BALB/c小鼠、恒河猴和LVG仓鼠，检测血清中和抗体、IgG和T细胞反应。
设计并筛选广谱刺突变异体STFK1628x
通过嵌合和突变修补获得与STFK抗原性互补的刺突蛋白。
基于Gamma变异株的RBD-S2，引入L452R/T478K突变，并替换为B.1.620的NTD，得到STFK1628x。在仓鼠中免疫筛选，评估其针对多种变异株的交叉中和能力。
评价二价疫苗的体液免疫反应
验证STFK+STFK1628x二价疫苗是否诱导广谱中和抗体。
用二价疫苗（1:1质量比）免疫仓鼠，检测针对19种变异株的假病毒中和抗体，包括Omicron亚系。
评估疫苗对变异株攻毒的保护效力
验证疫苗在仓鼠模型中抵御祖先株、Beta和Omicron BA.1感染的能力。
接种疫苗的仓鼠接受鼻内攻毒，监测体重、生存率、肺病毒载量和病理学变化。
评估疫苗对病毒传播的阻断能力
验证疫苗是否减少接种个体的病毒传播。
将接种或未接种的指数仓鼠攻毒后与未接种的哨兵仓鼠共笼，监测哨兵仓鼠的感染情况。
解析抗原的冷冻电镜结构
阐明STFK和STFK1628x的结构特征及其与抗体的结合模式。
通过cryo-EM解析STFK和STFK1628x与中和抗体复合物的结构，分析突变位点的差异。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 蛋白表达 | ExpiCHO-S细胞 | Thermo Scientific | A29127 |
| 蛋白纯化 | Ni Sepharose 6 Fast Flow | Cytiva | 17-5318-03 |
| MabSelect SuRe resin | Cytiva | 17-5474-02 | |
| 转染 | ExpiFectamine CHO转染试剂盒 | Thermo Scientific | A29129 |
| SDS-PAGE | 4-12% SurePAGE预制胶 | Genscript | M00653 |
| Native-PAGE | 非变性样品缓冲液 | BIO-RAD | 1610738 |
| 7.5% Mini-Protean TGX预制蛋白胶 | BIO-RAD | 4561024 | |
| 病毒RNA检测 | SARS-CoV-2 RT-PCR试剂盒 | Wantai | WS-1248 |
| RNA提取 | QIAamp病毒RNA小提试剂盒 | Qiagen | 52906 |
| 组织染色 | 伊红 | Maxim Biotechnology | CTS-4094 |
| ELISpot | 小鼠IFN-γ ELISpot试剂盒 | Dakewe Biotech | 2210005 |
| Cryo-EM | Quantifoil网格（R1.2/1.3，200目） | Quantifoil Micro Tools | -- |
| Gatan K3直接电子探测器 | Gatan | -- | |
| 高内涵分析 | Opera Phenix或Operetta CLS高内涵分析系统 | PerkinElmer | -- |
| ELISpot计数 | CTL-ImmunoSpot S5 | Cellular Technology Limited | -- |
| 组织匀浆 | TissueLyser II | Qiagen | -- |
| 病理图像采集 | EVOS M7000成像系统 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| 冷冻电镜数据采集 | FEI Tecnai F30透射电子显微镜 | ThermoFisher Scientific | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 免疫原性评价 | 疫苗剂量：小鼠0.01-10 μg/剂；猴1或15 μg/剂；仓鼠0.1-10 μg/剂。免疫途径：肌内注射。免疫间隔：小鼠2或3周、猴4周、仓鼠3周。 阅读提示：Methods中的‘Mouse immunizations’、‘Rhesus monkey immunizations’、‘Hamster immunizations’ |
| 攻毒保护实验 | 攻毒剂量：祖先株和Beta 1×10^4 PFU，Omicron BA.1 1×10^5 PFU。观察时间：7天（祖先株和Beta）或5天（Omicron）。 阅读提示：Methods中的‘SARS-CoV-2 virus challenges in hamster’及图3、图4图注 |
| 传播阻断实验 | 指数仓鼠攻毒剂量同上，共笼时间：1天，哨兵仓鼠观察时间：7天。 阅读提示：Methods中的‘SARS-CoV-2 virus challenges in hamster’及图5图注 |
| 中和抗体检测 | 假病毒中和试验使用VSV和慢病毒系统，活病毒中和试验使用200 TCID50病毒，血清起始稀释度1:4。 阅读提示：Methods中的‘Pseudovirus (PsV) neutralization assays’和‘Authentic SARS-CoV-2 neutralization assay’ |
| 病毒RNA定量 | 肺（0.1-0.2g）、鼻甲（0.8-1.2g）、气管（0.1-0.2g）组织，qRT-PCR检测ORF1ab基因，LOD=2 log10 copies/mL。 阅读提示：Methods中的‘SARS-CoV-2 RNA quantification’ |